補骨脂二氫黃酮甲醚對破骨細胞分化的影響及機制

魏晨旭 朱星宇,4 陸金蘭 夏晨潔 李偉東*

1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023 2.教育部中藥炮制規范化及標準化工程研究中心，江蘇 南京 210023 3.江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇 南京 210023 4.江蘇護理職業學院，江蘇 淮安 223001

補骨脂為傳統補腎健骨類中藥，來源于豆科植物補骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實，具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉的功效，用于腎陽不足、陽痿遺精、遺尿尿頻、腰膝冷痛等[1]。現代研究發現，補骨脂及所含活性成分對骨質疏松癥有著確切的治療作用，可以通過調節成骨細胞與破骨細胞的平衡從而緩解骨質疏松癥[2-3]。

黃酮類化合物是補骨脂中主要的一類化合物，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗骨質疏松等活性[4]。課題組前期研究了補骨脂中9種黃酮類化合物對成骨細胞的增殖、分化影響，發現在黃酮類化合物中，補骨脂中二氫黃酮類化合物對成骨細胞的增殖與分化作用最強[5]。骨質疏松是由于成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨吸收平衡失調所致[6]，因此，本實驗選取補骨脂中對成骨細胞作用最強的二氫黃酮類化合物，補骨脂二氫黃酮、異補骨脂二氫黃酮、補骨脂二氫黃酮甲醚考察其對破骨細胞分化的作用，并從NF-κB信號通路、PI3k/AKT信號通路、MAPK信號通路調節的角度探究其可能的作用機制，從而為補骨脂中二氫黃酮類化合物臨床治療骨質疏松的進一步應用研究提供實驗依據，促進其現代藥物的開發。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗儀器：恒溫培養箱(德國Memmert，INCO108)，電泳儀(美國 Bio-rad Power Supplies Basic)；Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉印系統(美國 Bio-rad 170-4150)；凝膠成像系統(英國 SYNGENE G:BOXChemiXR5)；多功能酶標儀(美國 MD Spectramac M3)。

1.1.2藥物與試劑：小鼠骨髓單核細胞分離液試劑盒(天津灝洋生物制品科技有限責任公司，批號：TBD2013DM)，rmRANKL(R&D公司，Catalog Number 462-TEC，Lot CWA2118041)、rmM-CSF(R&D公司，Catalog Number 416-ML，Lot ME4418061)。抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒(天津灝洋生物制品科技有限責任公司)。GAPDH (10B8)(中國 江蘇凱基生物技術股份有限公司 KGAA002)。p38(中國 北京博奧森生物科技有限公司 bs-0637R)。p-p38(中國 北京博奧森生物科技有限公司 bs-0636R)。p-JNK、JNK、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT、p-AKT、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p38、p-p38(USA Cell Signaling Technology)。

異補骨脂二氫黃酮(Isobavachin)(純度≥98%，批號：111220)，補骨脂二氫黃酮(Bavachin)(純度≥98%，批號：101026)，補骨脂二氫黃酮甲醚(Bavachinin)(純度≥99%，批號：110502)，以上標準品均購于南京世洲生物科技有限公司。

1.1.3實驗動物：ICR小鼠，5周齡(南京中醫藥大學實驗動物中心)，動物許可證號：SCXK(蘇)2014-0001，合格證編號：No.201813248。

1.2 實驗方法

1.2.1破骨細胞的提取及純化：破骨細胞的提取與純化主要參考前期研究的基礎[7]，步驟如下：第一天，取5周齡的ICR小鼠在無菌超凈臺內分離出股骨或脛骨，并剪開骨頭兩端露出內腔。勻漿沖洗液(產品編號：F2013TBD)沖洗出內腔中的骨髓。反復吹打成細胞懸液，以100 μm細胞篩網過濾至10 mL離心管中。450 g，離心10 min。棄上清，加入樣本稀釋液(產品編號：2010C1119)重懸細胞，備用。另取一只5 mL玻璃采血管，依次加入分離液1、分離液2和細胞懸液(分離液1與分離液2體積比為3∶1，先后加入分離液 1∶4 mL、分離液2∶1.33 mL。)制成梯度界面。500 g，離心30 min，此時離心需使用水平轉子離心機。離心后離心管中由上至下分為6層。吸取含有目的細胞的第二層環狀乳白色單核細胞層(第一層白環及上層 50%分離液2)到10 mL離心管中，加入5 mL洗滌液(產品編號：TBDTM-W)，混勻細胞。400 g，離心10 min。棄上清，加入5 mL清洗液(產品編號：2010X1118)重懸所得細胞。250 g，離心10 min。棄上清后加入適量15%的FBS重懸細胞，計數，向細胞懸液中加入巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)使其終濃度為30 ng/mL，將懸液吹打均勻，以密度1.8×105個/cm2種于96孔板中，每孔100 μL。

第二天，吸棄上清，換液，加入含100 ng/mL RANKL+50 ng/mL M-CSF和一定濃度藥物的15% FBS 280 μL。培養至第5天結束實驗。

1.2.2破骨細胞數量：于提取純化的第2天，細胞分為4組，分別給予補骨脂二氫黃酮(0.01、10、20、30、40 μmol/L)、異補骨脂二氫黃酮(0.1、5、10、15、30 μmol/L)、補骨脂二氫黃酮甲醚(0.01、1、10、20、30 μmol/L)，對照組不加藥物干預。培養第5天的破骨細胞，吸棄剩余上清液，4%多聚甲醛固定30 min，按照抗酒石酸酸性磷酸酶說明對破骨細胞進行抗酒石酸酸性磷酸酶染色，經電子顯微鏡拍照計數，拍得的圖片用Image J軟件進行分析處理，計算破骨細胞數量。

1.2.3抗酒石酸酸性磷酸酶活性：培養至第5天的破骨細胞，吸取上清液50 μL，按照抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒說明于405 nm條件下，用酶標儀測定每孔OD值，計算破骨細胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性，并算出各EC50值。

1.2.4作用機制初步研究：(1)細胞分組。實驗分為三大組，第一組測p65、p-p65蛋白表達，分為空白組、模型組(M-CSF+RANKL，記為M+R)、給藥組(Bavachinin+M-CSF+RANKL)、p65抑制劑組(PDTC 100 μmol/L+M-CSF+RANKL)；第二組測AKT、P-AKT蛋白表達，分為空白組、模型組(M-CSF+RANKL，記為M+R)、給藥組(Bavachinin+M-CSF+RANKL)、AKT激動劑組(LM22B-10 20 μmol/L+Bavachinin+M-CSF+RANKL)；第三組測p38、p-p38、JNK、P-JNK、ERK、P-ERK蛋白表達，分為空白組、模型組(M-CSF+RANKL，記為M+R)、給藥組(Bavachinin+M-CSF+RANKL)、p38激動劑組[Dehydrocorydaline chloride (DC)200 μmol/L+Bavachinin+M-CSF+RANKL]、JNK激動劑組(Juglanin 10 μmol/L+Bavachinin+M- CSF+RANKL)、ERK激動劑組(Honokiol，20 μmol/L+Bavachinin+M-CSF+RANKL)；其中空白組為不加因子刺激的單核細胞，補骨脂二氫黃酮甲醚給藥濃度為20 μmol/L，每組復3孔。給藥孵育1 h后，用于后續實驗。(2)Western blot。吸棄培養基后，加入預冷的PBS洗兩次，振搖數次以盡量去除培養液，按照BCA法測定蛋白濃度。蛋白通過10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后轉移至PVDF膜上。將膜與含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1.5 h，與一抗p38(1∶200)、p-p38(1∶200)、JNK(1∶1000)、p-JNK(1∶1000)、ERK1/2(1∶1000)、p-ERK1/2(1∶1000)、AKT(1∶1000)、p-AKT(1∶1000)、NF-κB p65 (1∶1000)、p- NF-κB p65 (1∶1000)以及GAPDH (1∶10000)，4 ℃搖床振蕩孵育過夜。第二天取出，室溫振蕩30 min，吸棄一抗，TBST洗10 min×3次后，室溫與二抗孵育2 h。最后，ECL化學發光劑盒進行染色，并用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目標蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值比值表示目標蛋白表達水平。

1.3 數據統計分析

數據采用均數±標準差表示，用SPSS 20.0統計學軟件進行統計處理，統計方法采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 破骨細胞分化過程

如圖1所示，原代細胞培養分離第1天，細胞呈球形，較小，形態均一；第2天，單核細胞已經貼壁，并且大小不一，可以明顯看到部分細胞生長變大，并且部分細胞開始變形，呈不規則形。第3天，細胞開始長出觸角，向周圍細胞發展，逐漸具有融合的趨勢。第4天，破骨細胞開始形成，呈不規則型，向四周聚集，出現大塊細胞融合區域。第5天為染色后的破骨細胞，細胞中心可以觀察到其細胞器的形狀及一些散在的細胞核。

2.2 補骨脂二氫黃酮類化合物對破骨細胞數量的影響

如圖2所示，與空白組相比，0.1～30 μmol/L的補骨脂二氫黃酮甲醚可以明顯減少破骨細胞的數量(P<0.05)，10～30 μmol/L的異補骨脂二氫黃酮可以明顯減少破骨細胞的數量(P<0.01)，20～40 μmol/L的補骨脂二氫黃酮可以明顯減少破骨細胞的數量(P<0.01)。以上結果說明，3種二氫黃酮類化合物對破骨細胞的形成均有一定的抑制作用。

2.3 補骨脂二氫黃酮甲醚對破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶活性的影響

如圖3所示，與空白組相比，1～30 μmol/L的補骨脂二氫黃酮甲醚可以明顯抑制破骨細胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性(P<0.05)，20～40 μmol/L的補骨脂二氫黃酮可以明顯抑制破骨細胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性(P<0.01)，5～30 μmol/L的異補骨脂二氫黃酮可以明顯抑制破骨細胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性(P<0.01)。以上結果說明，3種二氫黃酮類化合物對破骨細胞的形成均有一定的抑制作用。根據酶活性計算3個化合物對破骨細胞的EC50(μmol/L)，分別如下：補骨脂二氫黃酮甲醚12.39，異補骨脂二氫黃酮15.18，補骨脂二氫黃酮15.89。由EC50值可以看出，補骨脂二氫黃酮甲醚在3個化合物中對破骨細胞的抑制作用最強。

2.4 補骨脂二氫黃酮甲醚對NF-kB信號通路蛋白的影響

如圖4所示，與模型組相比，補骨脂二氫黃酮甲醚可以明顯降低p-p65/p65的值(P<0.05)，說明補骨脂二氫黃酮甲醚可以抑制p65的磷酸化。與p65磷酸化抑制劑PDTC對比，補骨脂二氫黃酮甲醚組的p-p65/p65值高于PDTC組(P<0.05)，說明補骨脂二氫黃酮甲醚對p65的磷酸化有一定抑制作用，但抑制強度弱于PDTC。

2.5 補骨脂二氫黃酮甲醚對PI3k/AKT信號通路蛋白的影響

如圖5所示，與模型組相比，補骨脂二氫黃酮甲醚可以顯著抑制AKT的磷酸化(P<0.01)。加入AKT磷酸化激動劑LM22B-10后，AKT磷酸化抑制作用被減弱，與給藥組相比磷酸化水平明顯升高(P<0.01)。

2.6 補骨脂二氫黃酮甲醚對MAPK信號通路蛋白的影響

如圖6所示，與模型組相比，補骨脂二氫黃酮甲醚可以顯著抑制ERK的磷酸化(P<0.01)，加入ERK磷酸化激動劑Honoliol后，ERK磷酸化抑制作用被減弱，與給藥組相比磷酸化水平明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，補骨脂二氫黃酮甲醚可以顯著抑制p38的磷酸化(P<0.01)，加入p38磷酸化激動劑DC后，p38磷酸化抑制作用被減弱，與給藥組相比磷酸化水平明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，補骨脂二氫黃酮甲醚可以顯著抑制JNK的磷酸化(P<0.01)，加入p38磷酸化激動劑Juglanin后，JNK磷酸化抑制作用被減弱，與給藥組相比磷酸化水平明顯升高(P<0.01)。

3 討論

骨質疏松癥是一種以骨量減少、骨微結構改變和脆性增加為主要特點的骨骼代謝性疾病，主要發生原因為成骨細胞與破骨細胞的平衡被打破[8]。

其中破骨細胞的過度激活是骨質疏松癥發生的重要原因，因此抑制破骨細胞的活性，成為治療骨質疏松癥的主要方法之一[9-10]。

抗酒石酸酸性磷酸酶是公認的破骨細胞標志之一，在骨吸收過程中參與骨基質中礦化底物的降解，其活性強弱標志著破骨細胞的活性，反映骨吸收的強弱[11]。本實驗首先通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色，發現補骨脂中3種二氫黃酮類化合物均可以減少破骨細胞的數量。在此基礎上，檢測各組的酶活性，并計算EC50值，結果發現，補骨脂二氫黃酮甲醚在3個化合物中表現出最強的破骨細胞分化抑制作用。因此，選取補骨脂二氫黃酮甲醚進行進一步的機制初步探討。

多條通路與骨質疏松的發生發展密切相關，其中OPG/RANK/RANKL途徑對骨穩態的調節具有重要作用。在OPG/RANK/RANKL信號通路中，單核細胞上的核因子-κB受體活化因子(RANK)被核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)激活后，引發多條信號傳導脈絡，可以促進破骨細胞的分化與增殖[3]。其中與破骨細胞分化最主要相關的3條通路如下：NF-κB信號通路、PI3k/AKT信號通路、MAPK信號通路。NF-κB通路在靜息狀態下，NF-κB的兩個亞單位p50/p65與IκB(NF-κB抑制蛋白)結合存在于細胞漿中。當TRAF6識別RANKL后通過NF-κB 可誘導性激酶(NIK)和NF-κB 激酶誘導劑(IKK)活化NF-κB，使其兩個亞單位p50/p65與IκB分離并迅速轉位進入細胞核來調節破骨細胞分化成熟或凋亡[12]。TRAF6識別RANKL后可激活c-Scr，進而激活PI3k磷酸化AKT，來調節破骨細胞骨架重置、移動并維持其存活[13-14]。MAPK信號通路：包括p38、JNK、ERK 3條支路，p38磷酸化通過活化下游轉錄因子調節破骨細胞骨吸收關鍵酶(如TRAP、CATK等)基因的表達促進破骨細胞的分化及骨吸收[15]；JNK磷酸化活化AP-1，誘導c-Fos表達來刺激破骨細胞前體分化成熟[16]；ERK磷酸化可以上調c-Fos的表達促進破骨細胞的分化[17-18]。本實驗發現，補骨脂二氫黃酮甲醚可以明顯下調p65、AKT、p38、JNK、ERK的磷酸化水平，說明補骨脂二氫黃酮甲醚對破骨細胞抑制作用可能與抑制NF-κB信號通路、PI3k/AKT信號通路、MAPK信號通路的激活有關。

綜上所述，補骨脂二氫黃酮甲醚對破骨細胞的分化表現出最強的抑制作用，其作用機制與抑制NF-κB信號通路、PI3k/AKT信號通路、MAPK信號通路的激活相關。本實驗結果為補骨脂二氫黃酮甲醚的進一步開發利用及骨質疏松癥的臨床治療提供參考。