新疆部分地區牛蜱傳無漿體和環形泰勒蟲調查

葛曉敏 ， 陳宋琴 ， 李才善 ， 鄭會珍 ， 郭慶勇

(新疆農業大學動物醫學學院 ， 新疆 烏魯木齊 830052)

蜱傳病原(Tick-borne pathogens，TBP)是一類經蜱傳播的病原，其中包括原蟲、微生物等。原蟲如泰勒蟲(Theileria)、巴貝斯蟲(Babesia)等；立克次體(Rickettsiales)如無漿體(Anaplasma)等[1-2]。無漿體是一種專性細胞內寄生的革蘭陰性病原體，屬于立克次體目(Rickettsiales)，無漿體科(Anaplasmataceae)，無漿體屬(Anaplasma)，其廣泛分布于世界各地，可造成動物的無漿體病。引起該病的主要病原有綿羊無漿體(Anaplasmaovis,A.ovis)、牛無漿體(Anaplasmabovis,A.bovis)等[3-5]；這些寄生菌的感染最終可導致溫和型或嚴重型的無血紅蛋白癥和血紅蛋白尿癥狀的貧血與黃疸等[6]。泰勒蟲是泰勒蟲屬(Theileria)專性胞內寄生的原生動物，在牛上能引起熱帶或地中海泰勒蟲病及東海岸熱病等[7]。環形泰勒蟲是主要病原之一，其感染癥狀有發熱、貧血、羞明流淚、黃疸、淋巴組織增生等[8-9]。

蜱傳病原都嚴重影響公共安全，危及動物福祉和畜主生計。本試驗采集新疆吐魯番、阿勒泰和伊犁州3個地區的牛全血樣品(n=356)，利用PCR檢測和統計分析方法，分別對3個地區的綿羊無漿體、牛無漿體和環形泰勒蟲3種病原在當地的感染情況進行了調查分析，旨在為后續的相關疾病流行病學調查研究及防控措施的建立提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2018年7月—2021年5月采用牛頸靜脈采血方式，共采集356份牛全血樣品(n=356)，其中，吐魯番地區155份(n1=155)、阿勒泰地區110份(n2=110)、伊犁州地區91份(n3=91)。將采集的牛全血放置于5 mL乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內，標記好后存放于4 ℃環境，備用。

1.1.2 主要試劑 血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒、pEASY-T1載體，均購自北京全式金生物技術有限公司；2×EcoTaqPCR Super Mix、DL-2 000 Marker，均購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒DNA提取試劑盒，均購自美國Axygen公司；DH5α感受態細胞，購自TaKaRa公司；病原檢測引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 主要儀器設備 電熱恒溫水浴鍋(型號為DK-600A)，購自上海一恒科學儀器有限公司；紫外凝膠成像儀(型號為 Gel Doc2000)、PCR儀，均購自美國Bio-Rad公司；臺式高速離心機(型號為RADIAL20)，購自西班牙ORTO ALRESA公司；瓊脂糖電泳儀(型號為 DYCP-31DN)，購自北京六一公司。

1.2 方法

1.2.1 牛全血DNA提取 按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取牛全血基因組DNA，并保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.2.2 病原檢測 通過DNAMAN和Premier 5.0軟件設計1對牛的綿羊無漿體的特異性引物，并參考陳宋琴等[10]設計的牛無漿體和實驗室已建立的環形泰勒蟲的特異性引物，利用PCR方法對牛綿羊無漿體、牛無漿體和環形泰勒蟲進行檢測。PCR擴增引物信息見表1。

表1 檢測3種病原使用的引物信息Table 1 Primer details used for detection of three pathogens

以提取的牛全血基因組DNA為模板，分別用特異性引物進行綿羊無漿體、牛無漿體和環形泰勒蟲的目的基因片段擴增。PCR擴增體系均為：2×EcoTaqPCR Super Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O至50 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，退火溫度根據表1設定，退火時間30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃再延伸10 min。擴增結束后，各取5 μL PCR擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，20 min后觀察電泳結果。將篩選出來的陽性樣品剩余的45 μL PCR產物重新進行凝膠電泳，步驟同上，之后將陽性條帶切下用DNA凝膠回收試劑盒進行回收和純化，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.3 測序和系統發育分析 按照pEASY-T1 Cloning Kit 說明書將回收的目的片段3 μL與1 μL pEASY-T1載體連接，導入至50 μL大腸桿菌DH5α感受態細胞，加入LB液體培養基，搖勻。搖菌管傾斜放置于搖床內200 r /min，37℃培養1 h。離心棄上清液，沉淀混勻涂板，篩選陽性單菌落，獲得重組質粒，將選取的菌株進行培養并提取質粒。以提取的重組質粒為模板使用相應的PCR引物進行鑒定，挑選PCR檢測結果為陽性的重組質粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將測序獲取的綿羊無漿體、牛無漿體的16S rRNA和環形泰勒蟲的Tams1基因序列在DNAMAN上進行比對，然后與NCBI GenBank數據庫中登錄的其他序列通過BLAST進行同源性比較。通過MEGA 7.0軟件采用鄰接(Neighbor-joining，NJ)法以統一模型分析并分別計算以上病原種間的遺傳距離并構建系統發育樹，Bootstrap值為1 000。

2 結果

2.1 3種病原的PCR檢測 利用表1所示引物序列，以牛全血基因組DNA為模板進行PCR擴增后，經瓊脂糖凝膠電泳，分別出現了牛的綿羊無漿體、牛無漿體和環形泰勒蟲的目的片段，大小分別為500、351 bp和527 bp，電泳結果見圖1。

圖1 綿羊無漿體、牛無漿體和環形泰勒蟲的PCR檢測Fig.1 PCR detection of A.ovis,A.bovis and T.annulataM:DL-2 000 DNA 相對分子質量標準； 1～7：檢測樣品； 8：陰性對照M:DL-2 000 DNA Marker; 1-7:Test samples； 8:Negative control

2.2 單一病原感染情況 對采集的356份牛全血樣品進行PCR檢測，3種病原在不同地區單一感染情況見表2。結果顯示，3個地區中綿羊無漿體的總感染率為21.9%(78/356)、牛無漿體總感染率為37.4%(133/356)、環形泰勒蟲總感染率為41.6%(148/356)；其中，綿羊無漿體在阿勒泰地區的感染率最高(29.1%，32/110)，吐魯番地區的感染率最低(14.8%，23/155)；牛無漿體在阿勒泰和伊梨州地區感染率相同，均為41.8%(46/110和38/91); 吐魯番地區的環形泰勒蟲感染率最高(43.2%，67/155)。運用SPSS軟件中的單因素方差分析對3個地區病原單一感染情況進行差異顯著性分析，結果表明，3個地區中牛單一感染綿羊無漿體、牛無漿體和環形泰勒蟲不存在顯著性差異(P>0.05)。

表2 3種病原單一感染調查情況Table 2 Investigation of single infection with three pathogens

2.3 3種病原混合感染情況 對采集的356份樣品進行PCR檢測，混合感染情況見表3。結果顯示，74頭牛(20.8%，74/356)感染了2～3種病原(雙重感染，n=63；三重感染，n=11)；最主要的雙重混合感染病原體是牛無漿體和環形泰勒蟲(78.4%，58/74)，其次是綿羊無漿體和牛無漿體(5.4%，4/74)；同時，有11頭牛感染了綿羊無漿體、牛無漿體和環形泰勒蟲3種蜱傳病原。

表3 3種病原混合感染情況調查Table 3 Investigation of mixed infection with three pathogens

2.4 測序及遺傳進化分析 測序比對結果顯示，綿羊無漿體、牛無漿體的16S rRNA和環形泰勒蟲的Tams1基因與NCBI GenBank數據庫中登錄的其他地區分離株的同源性分別是98%～100%、96%～99%和95%～98%。系統發育樹結果如圖2所示，伊犁州綿羊無漿體與中國廣西株(登錄號：EF587237)和烏干達株(登錄號：AF318945)同在一支，阿勒泰地區綿羊無漿體與中國甘肅株(登錄號：AJ633049)同在一支，吐魯番地區綿羊無漿體與中國浙江株(登錄號：JN558818)同在一支；此外，伊犁州和阿勒泰地區的綿羊無漿體遺傳距離較近，與吐魯番地區較遠。

圖2 綿羊無漿體16S rRNA基因系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of A.ovis 16S rRNA gene▲：本試驗測定的吐魯番、阿勒泰和伊犁州的A.ovis 16S rRNA基因序列▲：Sequence of A.ovis 16S rRNA gene in Turpan,Altay and Yili determined in this study

阿勒泰與吐魯番地區的牛無漿體分別與突尼斯株(登錄號：KM401903)和中國陜西株(登錄號：MN044717)處于同一支，伊犁州牛無漿體與俄羅斯株(登錄號：MT036513)屬同一支且親緣關系近；阿勒泰和吐魯番地區的無漿體遺傳距離較近，與伊犁州較遠，見圖3。

圖3 牛無漿體16S rRNA基因系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of A.bovis 16S rRNA gene▲：本試驗測定的吐魯番、阿勒泰和伊犁州的A.bovis 16S rRNA基因序列▲：Sequence of A.bovis 16S rRNA gene in Turpan,Altay and Yili determined in this study

吐魯番和阿勒泰地區環形泰勒蟲與埃及株(登錄號：AB917279)在同一支，伊犁州環形泰勒與印度株(登錄號：KP235484)屬同一支；阿勒泰和吐魯番地區的環形泰勒蟲的遺傳距離較近，與伊犁州較遠，見圖4。

圖4 環形泰勒蟲Tams1基因系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of T.anuulata Tams1 gene▲：本試驗測定的吐魯番、阿勒泰和伊犁州的T.annulata Tams1基因序列▲：Sequence of T.annulata Tams1 gene in Turpan,Altay and Yili determined in this study

3 討論

新疆位于我國西北邊陲，占總國土面積1/6，位于亞歐大陸腹地，與八國接壤，國際畜牧貿易頻繁[1]，畜牧業是當地主要經濟來源之一[11]。據前期文獻報道，多個地區出現牛感染環形泰勒蟲和無漿體等病原的病例[12]。新疆主要存在的無漿體病原有牛無漿體、綿羊無漿體和嗜吞噬細胞無漿體等[13]。其中，牛無漿體和綿羊無漿體流行最為廣泛。Liu等調查發現，牛無漿體和綿羊無漿體的單一病原體感染率分別為16.0%和15.3%，高于嗜吞噬細胞無漿體感染率(6.1%)[14]。環形泰勒蟲感染在新疆牛屬動物中普遍存在，在全疆14個地州的感染率高達20.9%[15]。新疆是該病的高發地區之一，據當地畜牧獸醫局統計，2010— 2012年因該病造成的牛只死亡率為24%[16]。

本試驗使用PCR方法對新疆3個地區牛的綿羊無漿體、牛無漿體和環形泰勒蟲進行檢測。結果發現，綿羊無漿體在阿勒泰地區感染率最高(29.1%，32/110)，吐魯番地區感染率最低(14.8%，23/155)，該結果與張玉婷等[11]報道的新疆阿勒泰地區、巴州地區的綿羊無漿體感染率(27%)相近。環形泰勒蟲在吐魯番地區的感染率最高(43.2%，67/155)，阿勒泰地區感染率最低(40.0%，44/110)，據文獻報道，吐魯番地區環形泰勒蟲病的總陽性率達49.5%(413/835)[16]，比本試驗的檢測結果略高。分析其主要原因可能是由于當地氣候條件、媒介分布和樣本量的差異等引起。Yang等[17]研究表明，新疆南疆綿羊無漿體的感染率為55.2%(69/125)。張晶等[18]對新疆南疆21個(市、縣)地區637份羊血液樣品進行檢測，結果發現綿羊無漿體感染率為72.2%。本試驗結果顯示，吐魯番、伊犁州和阿勒泰3個地區的牛血液樣品中綿羊無漿體總感染率為21.9%，均比上述研究結果低；該結果表明綿羊無漿體可能存在跨宿主傳播，且在不同種宿主間的感染率存在差異。

本試驗結果還發現，有74頭牛出現混合感染情況(雙重感染，n=63；三重感染，n=11)，混合感染率最高的是環形泰勒蟲和牛無漿體。此次檢測地區養殖類型以散養為主，且大多家畜是混合飼養，這為蜱蟲在各個動物間爬行吸血傳播病原提供有利條件[1]，從而增加了家畜混合感染的可能性。用PCR方法針對牛綿羊無漿體、牛無漿體和環形泰勒蟲的16S rRNA和Tams1基因序列擴增，并在NCBI上進行比對，同源一致性結果分別為98%～100%、96%～99%和95%～98%。遺傳進化分析結果顯示，伊犁州和阿勒泰地區的綿羊無漿體親緣關系較近，與吐魯番地區親緣關系較遠；阿勒泰和吐魯番地區的牛無漿體、環形泰勒蟲的親緣關系較近，與伊犁州地區親緣關系較遠。

本試驗病原均為蜱傳病原，一般在蜱吸血時將病原傳播給家畜。有報道指出滅蜱計劃在亞熱帶邊緣地區已取得成功，扇頭蜱分布在美國南部和阿根廷中部，這些地區的扇頭蜱和巴貝斯蟲病已得以根除，非洲南部的東海岸熱病(由泰勒蟲傳播)已被消滅[19]。為了減少家畜被感染的風險，消滅蜱蟲起到至關重要的作用。畜主應及時消滅家畜身上及環境中的蜱，或在蜱蟲多發季節前加強對蜱蟲的防控，試圖切斷病原傳播途徑，減少蜱傳疾病的發生。