偽狂犬病病毒TaqMan雙重實時熒光定量PCR檢測方法的建立與初步應用

呂玉金 ， 張世軍 ， 吳鳳筍 ， 趙攀登 ， 劉玲玲 ， 李文剛 ， 饒 寶

(1.河南牧業經濟學院動物醫藥學院 ， 河南 鄭州 450046 ； 2.河南農業大學動物醫學院 ， 河南 鄭州 450002 ；3.牧原食品股份有限公司 ， 河南 南陽 473000)

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)屬于皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，在自然界中廣泛存在，是引起豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)的病原體。PRV唯一的自然宿主是豬，仔豬感染后表現為中樞神經系統紊亂，死亡率可達100%；成年豬感染后通常表現為呼吸道癥狀和增重減緩，急性感染耐過的豬則終身隱性帶毒；懷孕母豬感染后常發生繁殖障礙[1-2]。20世紀80年代以來，Bartha-K61等疫苗的使用對PRV的傳播和危害起到了有效的控制作用。但2011年后，由于PRV發生變異導致病毒的毒力增強，豬偽狂犬病再次暴發，由華中地區陸續流行到華南、華北及西南等地區的已經免疫過弱毒疫苗的豬場，且Bartha-K61等傳統弱毒疫苗不能對目前PRV流行毒株提供有效的免疫保護[3-6]。近年來，國內外多次出現PRV感染人的報道，加速了PRV根除凈化警報[7-9]。因此，快速、準確的診斷方法對該病的防控具有重要意義。

本試驗基于國內PRV野毒株基因序列，根據PRVgB和gE基因保守區域，設計特異性引物和探針，建立可用于臨床樣本中PRV野毒株和疫苗株檢測的TaqMan雙重實時熒光定量PCR方法，旨在為PRV的檢測和防控提供有效的保障。

1 材料與方法

1.1 病毒株及臨床樣品 病料組織于2020年6月采集自河南省新鄉市某一豬場；PRV Bartha-K61疫苗株，購自武漢科前生物有限公司；PRV陽性對照毒株HNJY株、豬腎細胞(PK-15)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細小病毒(PPV)、豬圓環病毒2型(PCV2)和豬乙型腦炎病毒(JEV)，均由河南牧業經濟學院中心實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器 pMD18-T Vector、ExTaq酶和PremixExTaqTM(Probe qPCR),均購自寶生物工程(大連)有限公司；Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒和SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。ABI-7500 Fast熒光定量PCR儀，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 引物和探針設計 利用DNASTAR(Version 5.0)軟件對GenBank 中2012年以來公布的PRV流行毒株gE和gB基因序列進行同源性對比分析(圖1和圖2)，選擇各自保守區域設計2對特異性引物和探針，并將探針標記上不同的發光基團，使其能夠區分野毒株和疫苗株，引物和探針序列見表1。

圖1 PRV-gE引物和探針設計Fig.1 Design of PRV-gE primers and probe

圖2 PRV-gB引物和探針設計Fig.2 Design of PRV-gB primers and probe

表1 熒光定量PCR引物和探針Table 1 Primers and probe of fluorescence quantitative PCR

1.4 重組質粒標準品的制備 以本實驗室保存的PRV病毒的基因組為模板，進行PCR擴增，獲得目的片段。將PCR目的片段膠回收純化克隆至pMD18-T Vector中，并將重組載體轉化至DH5α感受態細胞，經菌液鑒定和一代測序，篩選陽性克隆，擴大培養后提取質粒，得到pMD-gB和pMD-gE重組質粒。使用紫外分光光度計測定重組質粒的濃度，根據公式(1)換算出拷貝數[10]。

拷貝數(copies/μL)=[6.02×1023×質粒濃度(ng/μL)×10-9]÷[660×(pMD18-T)載體堿基數+目的片段堿基數]

(1)

1.5 雙重實時熒光定量PCR反應條件的優化 采用20 μL反應體系：PremixExTaq(Probe qPCR)(2×Conc) 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×Conc) 0.4 μL，DNA模板2 μL，TaqMan探針(10 μmol/L)和上下游引物(10 μmol/L)的終濃度在0.1～0.8 μmol/L調整，用超純水補齊至20 μL。然后對雙重實時熒光定量PCR各循環參數和引物濃度等進行優化，以確定最佳的雙重實時熒光定量PCR反應體系。

1.6 雙重實時熒光定量PCR標準曲線的繪制 取PRV-gE、PRV-gB重組標準質?；靹?，進行10倍倍比梯度稀釋，以各個梯度重組標準質粒作為標準模板，用優化后的PCR反應最適條件進行擴增，每個數量級重復3次，得出結果進行分析，以對應標準質粒的拷貝數為橫軸，Ct值為縱軸建立標準曲線[11]。

1.7 特異性試驗 利用本試驗建立的TaqMan雙重實時熒光定量PCR方法分別對PRV-gE重組標準質粒、PRV-gB重組標準質粒、PRV野毒株、PRV Bartha-K61疫苗株、CSFV、PRRSV、PPV、PCV2和JEV進行檢測，分析該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗 取濃度數量級為100～107copies/μL的重組標準質粒作為DNA模板進行實時熒光定量PCR，每個稀釋度做3個重復，以確定該方法的最低檢測限度。隨后利用普通PCR方法進行擴增[12]，分析檢測結果得出最低檢測濃度，并與本試驗建立的TaqMan雙重實時熒光定量PCR方法進行靈敏性對比。

1.9 重復性試驗 取濃度數量級為104～106copies/μL 共3個稀釋度DNA為模板，分別進行3次重復擴增，進行組內和組間重復性試驗。根據所得結果的Ct值，計算Ct值的平均數(MN)和標準差(SD)[13],最后根據公式(2)計算變異系數(CV)[14]來驗證實時熒光定量PCR的批內重復性。

CV=(SD÷MN)×100%

(2)

1.10 干擾性試驗 將PRV-gB和PRV-gE重組質粒標準品按不同的拷貝數進行組合，分別用雙重實時熒光定量PCR和單項熒光PCR進行檢測，確定模板濃度相差較大時二者的檢測是否存在干擾。

1.11 臨床樣品檢測 按照生工生物工程(上海)股份有限公司DNA抽提試劑盒說明書對實驗室保存的18份豬臨床病料進行基因組提取，采用所建立的PRVgE和gB基因TaqMan雙重實時熒光定量PCR方法對病料進行檢測。隨后利用普通PCR方法進行擴增[12]，分析檢測結果，并與本試驗建立的TaqMan雙重實時熒光定量PCR方法結果進行對比。

2 結果

2.1 重組質粒標準品的制備 對PRVgB和gE基因進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠回收后與pMD18-T Vector連接，提取質粒進行雙酶切鑒定，PRVgE基因的重組質粒顯示2 061 bp和2 877 bp 2個條帶，PRVgB的重組質粒顯示2 640 bp和2 877 bp 2個條帶，與預期大小一致(圖3)。對陽性質粒進行濃度測定，PRV-gB和PRV-gE重組質粒的濃度分別為164.0 ng/μL和141.5 ng/μL，使用公式(1)計算其拷貝數分別為2.74×1010copies/μL和2.71×1010copies/μL。

圖3 PRV-gE和PRV-gB重組質粒的雙酶切鑒定Fig.3 Double digestion identification of PRV-gE and PRV-gB recombinant plasmidsM：DL5 000 Marker； 1：PRV-gB雙酶切產物； 2：PRV-gE雙酶切產物M：DL5 000 Marker； 1：PRV-gB double enzymes digestion products；2：PRV-gE double enzymes digestion products

2.2 雙重實時熒光定量PCR標準曲線的繪制 經過對TaqMan雙重實時熒光定量PCR反應條件的優化，確定該反應體系PRV-gB-F、PRV-gB-R、PRV-gE-F和PRV-gE-R引物的最佳工作終濃度為0.2 μmol/L，PRV-gB-P和PRV-gE-P探針的最佳工作終濃度分別為0.3 μmol/L和0.2 μmol/L；PCR的最佳反應條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，40個循環；最后于4 ℃結束反應。在最佳的反應體系和反應條件下，對濃度數量級為102～108copies/μL的gE、gB基因的標準陽性質粒模板進行檢測，建立雙重實時熒光定量PCR標準曲線。結果如圖4所示，gE、gB基因線性方程分別為：gE：y=-3.154x+46.08；gB：y=-3.120 8x+45.235，相關系數分別為0.997 9和0.990 6，擴增效率分別為99.626%和99.779%。

圖4 TaqMan雙重實時熒光定量PCR的標準曲線Fig.4 Standard curve of TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCRA：PRV gE基因TaqMan雙重實時熒光定量PCR的標準曲線；B：PRV gB基因TaqMan雙重實時熒光定量PCR的標準曲線A：Standard curve of PRV gE gene TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCR；B：Standard curve of PRV gB gene TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCR

2.3 特異性試驗 分別采用所建立的PRVgE和gB基因TaqMan雙重實時熒光定量PCR方法對樣品進行檢測。結果如圖5所示，PRV野毒株、PRV-gB重組標準質粒和PRV Bartha-K61疫苗株在FAM熒光通道(530 nm激發光下)出現S型擴增曲線，PRV野毒株、PRV-gE重組標準質粒在JOE熒光通道(478 nm激發光下)出現S型擴增曲線，其他則在FAM和JOE熒光通道為直線，與試驗設計相符。

圖5 TaqMan雙重實時熒光定量PCR的特異性Fig.5 Specificity of TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCRA：PRV gB基因TaqMan雙重實時熒光定量PCR特異性試驗結果(1：PRV-gB重組標準質粒； 2：PRV野毒株； 3：PRV Bartha-K61疫苗株；4～9:PRV-gE重組標準質粒、CSFV、PRRSV、PPV、PCV2和JEV)； B：PRV gE基因TaqMan雙重實時熒光定量PCR特異性試驗結果(1：PRV-gE重組標準質粒； 2：PRV野毒株； 3～9：PRV-gB重組標準質粒、PRV Bartha-K61疫苗株、CSFV、PRRSV、PPV、PCV2和JEV)A：PRV gB gene TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCR specificity test results(1：PRV-gB recombinant standard plasmid； 2：PRV wild strain；3：PRV Bartha-K61 vaccine strain； 4-9:PRV-gE recombinant standard plasmid,CSFV,PRRSV,PPV,PCV2 and JEV)B：PRV gE gene TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCR specificity test results(1：PRV-gE recombinant standard plasmid； 2：PRV wild strain；3-9: PRV-gB recombinant standard plasmid，PRV Bartha-K61 vaccine strain,CSFV,PRRSV,PPV,PCV2 and JEV)

2.4 敏感性試驗 采用所建立的PRVgE和gB基因TaqMan雙重實時熒光定量PCR方法對PRVgE和gB基因的2種重組標準質粒的混合品進行靈敏度檢測，結果顯示，建立的方法對PRVgB基因重組標準質粒的模板最低檢測量為2.74 copies/μL(圖6A)，建立的方法對PRVgE基因重組標準質粒的模板最低檢測量為27.1 copies/μL(圖6B)。

圖6 TaqMan雙重實時熒光定量PCR的敏感性Fig.6 Sensitivity of TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCRA：PRV gB基因TaqMan雙重實時熒光定量PCR敏感性試驗結果(1～7:PRV gB基因的重組質粒的濃度分別為2.74～2.74×106 copies/μL)；B：PRV gE基因TaqMan雙重實時熒光定量PCR敏感性試驗結果(1～6:PRV gE基因的重組質粒的濃度分別為27.1～2.71×106 copies/μL)A：PRV gB gene TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCR sensitivity test results(1-7: PRV gB gene recombinant plasmids at 2.74-2.74×106 copies/μL)；B：PRV gE gene TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCR sensitivity test results(1-6: PRV gE gene recombinant plasmids at 27.1-2.71×106 copies/μL)

2.5 重復性試驗 根據所得結果的Ct值，計算Ct值的MN、SD和CV，如表2所示，兩組數據的變異系數均小于1%，結果表明本方法具有良好的重復性。

表2 重復性試驗結果Table 2 Results of repeatability test

2.6 干擾性試驗 將PRV gE和gB重組標準質粒標準品模板按不同濃度進行組合時發現，當一個模板濃度高而另一個模板濃度低時，仍可在不同的熒光通道下分別檢測到2個模板，并與單一熒光PCR檢測結果無顯著差異(圖7)。

圖7 TaqMan雙重實時熒光定量PCR的干擾性Fig.7 Robustness of TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCRA：1：PRV gE重組標準質粒標準品模板濃度為2.71×108 copies/μL； 2：PRV gB重組標準質粒標準品模板濃度為2.74×103 copies/μL；B：1：PRV gE重組標準質粒標準品模板濃度為2.71×103 copies/μL； 2：PRV gB重組標準質粒標準品模板濃度為2.74×108 copies/μLA：1：PRV gE recombinant standard plasmid standard template concentration is 2.71×108 copies/μL； 2：PRV gB recombinant standard plasmid standard template concentration is 2.74×103 copies/μL； B：1：PRV gE recombinant standard plasmid standard template concentration is 2.71×103 copies/μL； 2：PRV gB recombinant standard plasmid standard template concentration is 2.74×108 copies/μL

2.7 臨床樣品檢測 通過本試驗建立的方法對保存的18份樣品進行檢測分析，結果如表3所示，18份病料中共檢出gB基因陽性病料10份，陽性率為55.6%；檢出gE基因陽性病料7份，陽性率為38.9%；混合感染病料為5份，占比27.8%，且該檢測結果與普通PCR方法鑒定結果符合率達100%。說明本試驗建立的TaqMan雙重實時熒光定量PCR的檢測方法較適用于臨床樣品的檢測。

表3 臨床樣品檢測結果Table 3 Results of clinical sample

3 討論

近年來，在我國許多地區都報告了PR的暴發，目前所使用的Bartha-K61疫苗不能為新型的PRV變異毒株提供足夠的保護?？紤]到國內進行大規模疫苗接種，豬群中可同時存在PRV野毒株和疫苗株。在豬偽狂犬病凈化過程中，開發區分不同PRV毒株的檢測方法是必要的，且需求日益增加[15]。

隨著研究的不斷深入，現已經開發出很多可對PRV毒株進行鑒定的方法。謝思豪等[16]建立了PRV野毒株新型可視化LAMP檢測方法，其結果直觀且極易分辨，最低的檢測限度可達100.5TCID50，雖然該方法靈敏度高，但是結果易出現假陽性。張悅勇等[17]建立了豬偽狂犬病病毒納米PCR檢測方法，該方法操作簡單，敏感度高，最低的檢出限為10 copies/μL，但是該方法不能對疫苗株和野毒株同時進行檢測，也不能夠實現對病原定量檢測，且納米材料不易獲得。蘭德松等[18]以PRVgB和gE基因為靶基因，建立PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株的鑒別診斷和準確定量的微滴式數字PCR方法，最低的檢測限度為2.3 copies/μL，但該方法操作復雜，對檢測人員要求高，不適合基層檢測。吳鳳筍等[12]構建了豬偽狂犬病病毒檢測基因芯片，該方法特異性強，靈敏度高，檢測的最低量可達1×10-6ng級，但由于該方法操作過程繁瑣且價格昂貴，限制了其推廣。此外，臨床上也使用ELISA方法通過對豬體內gE抗體水平進行檢測，從而區分疫苗株和野毒株，但是抗體的產生具有滯后性，在免疫細胞呈遞抗原的這段時間抗體檢測幾乎沒有作用，對病毒的早期檢測不如實時熒光定量PCR及時。通過與以上研究對比分析發現，熒光實時定量PCR相對于其他的檢測方法來說，操作簡單、特異性強、靈敏性好、價格便宜、時效性早，更加適用于臨床檢測。

綜上所述，本試驗建立的TaqMan雙重實時熒光定量PCR檢測方法，可同時檢測PRV野毒株和疫苗株，尤其是對PRV早期檢測更有效果，這將對臨床上PR的診斷與防控提供一種更加有效的解決方案。