犢牛源大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

梁 圓 ， 張丹丹 ， 程 景 ， 李 博 ， 靳 光 ， 王棟才 ， 張元慶

(1.山西農業大學動物醫學學院 ， 山西 太原 030031 ； 2.山西農業大學動物科學學院 ， 山西 太原 030032)

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)是一種腸道常見菌，可引起犢牛腹瀉、出血性腸炎等癥狀。目前抗生素仍是治療大腸桿菌感染的重要手段，但隨著養牛業規模化程度迅速提高，犢牛腹瀉的發病率逐年上升，大量抗菌藥物的不合理使用導致大腸桿菌耐藥性問題頻發，交叉耐藥和多重耐藥也愈發嚴重，臨床治療難度加大，給養殖場造成了重大的經濟損失[1-2]。細菌為了更好的適應外部環境，可通過多種途徑將抗菌藥物對自身的影響最小化，其中對可移動基因元件(轉座子、整合子、整合與接合元件)的研究越來越受青睞，整合子是一種存在于細菌染色體、質粒和轉座子上的可移動基因元件，是耐藥基因水平傳播的重要媒介，它可以通過位點特異性重組整合耐藥基因盒，使細菌產生耐藥性[3-5]。

本研究采集晉北地區規模化牛場腹瀉犢牛肛拭子分離鑒定大腸桿菌，開展藥物敏感性、耐藥基因和整合子-基因盒的檢測，探究耐藥表型與所攜帶耐藥基因和整合子的相關性，為養殖場合理用藥和牛源大腸桿菌耐藥機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源和主要試劑 2020年從晉北忻州、朔州和大同市3個養牛場無菌收集腹瀉犢牛肛門拭子27份。伊紅美藍瓊脂、麥康凱瓊脂和Luria-Bertani(LB)肉湯，均購自金克隆生物技術有限公司；藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、2×TaqPCR Mix、DNA Marker等，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 細菌分離及PCR鑒定 在放有肛門拭子的2 mL離心管中加入1.5 mL LB肉湯，于37 ℃培養4 h后，劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養過夜，挑取粉紅色單菌落接種于1 mL LB肉湯中，37 ℃培養3 h后劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板，37 ℃培養過夜，挑取帶金屬光澤的紫黑色單菌落接種于LB肉湯增殖培養。

從GenBank下載大腸桿菌16S rRNA基因序列(OK148132.1)，利用Primer-BLAST設計引物(F：5′-ACGCGAAGAACCTTACCTGG-3′/R：5′-CTCCAATCCGGACTACGACG-3′)，以分離株培養液提取的基因組DNA為模板進行PCR鑒定，隨機選擇5份PCR產物測序。

1.3 分離株耐藥表型檢測 參照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)推薦的紙片擴散法(K-B法)進行藥敏試驗，測定分離株對6類15種抗菌藥物的敏感性。

1.4 分離株耐藥基因檢測 從GenBank下載大腸桿菌耐藥基因序列(6類15種)，包括β-內酰胺類：blaTEM、blaCTX-M-1；氨基糖苷類：aadA1、strA；磺胺類：sul1、sul2；喹諾酮類：GyrA、GyrB、ParC；氯霉素類：cat、FloR、cmlA；四環素類：tetA、tetB、tetM，利用Primer-BLAST在線設計引物，引物序列見表1。以分離株基因組DNA為模板，采用PCR檢測上述各類耐藥基因。

1.5 分離株整合子-基因盒檢測 參照參考文獻[6]合成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子的整合酶(Integrase,intI)基因引物及耐藥基因盒結構的引物。以基因組DNA為模板，檢測分離株整合子的攜帶情況，對攜帶整合子的菌株PCR擴增可變區，產物測序后結果經GenBank數據庫序列比對，以分析可變區基因盒結構和3′保守區域。

1.6 耐藥表型與耐藥基因、整合子-基因盒的相關性分析 以在耐藥基因陽性菌株中表型耐藥菌株的占比計算耐藥基因與耐藥表型的符合率；利用SPSS 17軟件采用Fisher確切概率法分析整合子與耐藥表型的相關性，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 細菌分離及PCR鑒定 將采集的犢牛肛拭子培養液劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，長出粉紅色菌落；接種于伊紅美藍瓊脂平板上，長出帶綠色金屬光澤的紫黑色菌落，再通過16S rDNA菌種鑒定，最后得到牛源大腸桿菌24株。

2.2 分離株耐藥表型檢測 藥敏試驗結果如圖1所示，24株牛源大腸桿菌對6類15種抗菌藥物呈現不同程度的耐藥，對β-內酰胺類抗菌藥耐藥性最高，頭孢噻肟、頭孢唑林和氨芐西林耐藥菌株占95.83%(23/24)；對喹諾酮類抗菌藥耐藥性最低，諾氟沙星、環丙沙星和氧氟沙星耐藥菌株占比分別為16.67%(4/24)、16.67%(4/24)、12.50%(3/24)；對氨基糖苷類、四環素類和氯霉素類抗菌藥耐藥的菌株占比在16.67%～70.83%，其中對氨基糖苷類抗菌藥耐藥水平跨度較大，慶大霉素耐藥菌株占62.50%(15/24)，而對阿米卡星較敏感，耐藥菌株占比為16.67%(4/24)。

圖1 24株大腸桿菌對15種抗菌藥物的耐藥情況Fig. 1 Resistance of 24 strains of E.coli to 15 kinds of antibacterial drugsCTX：頭孢噻肟; CZ：頭孢唑林; AMP：氨芐西林; SM：鏈霉素; KM：卡那霉素; CN：慶大霉素; AK：阿米卡星; TMP：甲氧芐啶; SXT：復方新諾明; NOR：諾氟沙星; CIP：環丙沙星; OFX：氧氟沙星; TET：四環素; DO：多西環素; C：氯霉素； 下同CTX：Cefotaxime; CZ：Cephazolin; AMP：Ampicillin; SM：Streptomycin; KM：Kanamycin; CN：Gentamicin; AK：Amikacin; TMP：Trimethoprim; SXT：Compound sulfamethoxazole; NOR：Norfloxacin; CIP：Ciprofloxacin; OFX：Ofloxacin; TET：Tetracycline; DO：Doxycycline； C：Chloramphenicol. The same as below

表1 耐藥基因引物Table 1 Primers for resistance genes

24株牛源大腸桿菌中，對3類及3類以上抗菌藥物耐藥的多重耐藥菌占70.83%(17/24)，對所測試抗菌藥物全部敏感的菌株占4.17%(1/24)，有3株菌對14種抗菌藥物都耐藥。多重耐藥集中分布在4～6重，4重耐藥占比最高，為33.33%(8/24)，多重耐藥譜型共有14種，以CTX+CZ+AMP+TMP+SXT+SM+TET+CN占比最高，為12.50%(3/24)(表2)。

表2 大腸桿菌分離株的多重耐藥譜型Table 2 Type of multi-drug resistance of E.coli isolates

2.3 分離株耐藥基因檢測 采用PCR檢測24株大腸桿菌對6類15種耐藥基因的攜帶情況，結果如圖2所示，6類耐藥基因均有檢出，共檢測到13種耐藥基因，檢出率分別為：β-內酰胺類耐藥基因blaTEM(79.17%)、blaCTX-M-1(79.17%)；氨基糖苷類aadA1(8.33%)、strA(75.00%)；磺胺類sul1(62.50%)、sul2(70.83%)；喹諾酮類GyrA(95.83%)、GyrB(100%)、ParC(83.33%)；氯霉素類cat(4.17%)、FloR(37.50%)；四環素類tetA(66.67%)、tetB(8.33%)，沒有檢測到tetM和cmlA耐藥基因。

圖2 大腸桿菌耐藥基因的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of E.coli resistance genesM：DL600 Marker； 1～13：blaCTX-M-1、blaTEM、strA、aadA1、sul1、sul2、GyrA、GyrB、ParC、tetA、tetB、cat、FloR

2.4 分離株整合子-基因盒檢測 24株大腸桿菌中，檢出有19株攜帶Ⅰ類整合子(圖3A)，檢出率為79.17%(19/24)，未檢出Ⅱ、Ⅲ類整合子。

圖3 Ⅰ類整合子-基因盒的PCR擴增Fig.3 PCR amplification of class I integron-gene cassetteA:整合酶基因的PCR擴增(M：DL600 Marker； 1：Ⅰ類整合酶陽性株)； B:可變區基因盒的PCR擴增(M：DL2 000 Marker； 1～9：Ⅰ類整合酶陽性菌株可變區)A:PCR amplification of integrase gene(M:DL600 Marker; 1:intI1-positive isolates); B:PCR amplification of gene cassette in variable region(M:DL2 000 Marker; 1-9:Variable region of intI1-positive isolates)

對19株Ⅰ類整合子陽性菌株進行可變區PCR擴增，共有9株分離菌擴增出可變區片段(圖3B)，將PCR產物測序后比對分析，結果顯示，共有3種不同的基因盒排列，其中有5株分離菌基因盒結構為dfrA17-aadA5，有3株分離菌為單基因基因盒(dfrA7)，有1株分離菌同時含有2種基因盒(dfrA1-aadA1和dfrA7)；對3′保守區域序列分析，顯示9株分離菌均為典型結構qacEΔ1+sul1。

2.5 分離株耐藥基因與耐藥表型的相關性分析 計算耐藥基因與耐藥表型的符合率，結果顯示，7個耐藥基因(β-內酰胺類：blaTEM、blaCTX-M-1；磺胺類：sul1、sul2；四環素類：tetA、tetB；氯霉素類：cat)與耐藥表型符合率為100%，耐藥基因FloR和strA與耐藥表型符合率分別為77.78%和50.00%，而喹諾酮類耐藥基因(GyrA、GyrB、ParC)與耐藥表型符合率都較低，分別為15.00%、14.28%、11.76%。

2.6 分離株多重耐藥表型與整合子-基因盒的相關性分析 采用Fisher確切概率法對24株大腸桿菌按多重耐藥菌株數與整合子陽性菌株數進行檢驗，結果如表3所示，整合子陽性菌株的多重耐藥發生率極顯著高于整合子陰性菌株(P<0.01)。

表3 Ⅰ類整合子和大腸桿菌多重耐藥性相關性分析Table 3 Correlation of class I integrons and multi-drug resistance in E.coli

分離株攜帶5種不同的基因盒，賦予了對氨基糖苷類(aadA1、aadA5)和甲氧芐啶(dfrA1、dfrA7、dfrA17)的耐藥性，分析分離株的基因盒排列類型與對應的耐藥表型，發現攜帶相同基因盒排列的菌株在耐藥表型組合上有較大差異；但基因盒陽性菌株表型上對氨基糖苷類和磺胺類的某種藥物耐藥時，菌株一定攜帶著與表型相對應的基因盒。

3 討論

細菌耐藥性已成為世界突出的公共衛生問題，尤其養殖業中存在不合理使用抗生素，甚至將其作為促生長劑使用的現象，大大加快了耐藥性的出現，目前很多研究已證實大腸桿菌耐藥性正逐年升高[7]。本研究檢測分離的24株大腸桿菌對臨床常用的6大類15種抗菌藥的敏感性，發現分離株耐藥情況嚴重，對氨芐西林、頭孢噻肟等β-內酰胺類抗菌藥耐藥率在95%以上，對復方新諾明和四環素的耐藥率也在70%以上，可能與養殖場頻繁使用此類藥物治療各種細菌病有關。值得注意的是，同屬氨基糖苷類的慶大霉素(62.50%)和阿米卡星(16.67%)耐藥率相差近4倍，這可能與養殖場長期使用單一抗菌藥有關。大腸桿菌分離株的多重耐藥情況也很嚴重，多重耐藥菌株占比70.83%，其中3株分離菌對14種藥物都表現為耐藥。高海慧等[8]分離的牛源大腸桿菌對氨芐西林、頭孢唑林和四環素耐藥率超過90%，對環丙沙星和諾氟沙星的耐藥率超過60%，多重耐藥菌株占比達85.33%；劉勃興等[9]分離的牛源大腸桿菌對磺胺類抗菌藥高度耐藥，對β-內酰胺類和喹諾酮類抗菌藥的耐藥率在30%以下，對10種及以上抗菌藥耐藥的菌株占比34%。與本研究結果相比，發現各地區大腸桿菌多重耐藥問題均很嚴重，但不同地區大腸桿菌對各類抗菌藥物的敏感性有較大差異。

本研究檢測分離株對6大類抗菌藥所對應的各類耐藥基因的攜帶情況，發現除tetM和cmlA耐藥基因外，其余耐藥基因均可檢出，喹諾酮類耐藥基因檢出率最高，β-內酰胺類次之，氯霉素類最低。耐藥基因GyrB檢出率達100%，是喹諾酮類耐藥基因中最流行的基因型，磺胺類耐藥基因sul1、sul2檢出率超過62%，與吳同壘等[10]分離的牛源大腸桿菌中耐藥基因GyrB(100%)、sul1(66.7%)的檢出率非常接近。耐藥基因blaTEM檢出率為79.17%，與吳少鵬等[11]在牛糞中分離的大腸桿菌耐藥基因blaTEM(59.1%)檢出結果相似，均為β-內酰胺類耐藥基因中占優勢的基因型。氯霉素類耐藥基因FloR的檢出率為37.5%，是白慧麗等[12]分離的大腸桿菌中耐藥基因FloR(76.92%)檢出率的1/2，可能與后者所采樣的養牛場長期使用氟苯尼考有關。進一步分析耐藥基因與耐藥表型的相關性，發現β-內酰胺類、磺胺類和四環素類耐藥基因與耐藥表型的符合率都為100%，而喹諾酮類耐藥基因與耐藥表型的符合率最高為15%，表明除喹諾酮類耐藥基因外，通過對分離株耐藥基因的檢測可在一定程度上預測菌株的耐藥表型，目前藥敏試驗是檢測細菌耐藥表型的有效手段，但檢測耐藥基因對研究分離菌株的潛在耐藥性意義重大。

整合子對細菌耐藥的產生有著不可忽視的作用，近年來對整合子的研究越來越多，其中對Ⅰ類整合子的研究最多，Ⅱ、Ⅲ類較少。本研究檢測分離株中三類整合子的攜帶情況，發現79.17%大腸桿菌攜帶Ⅰ類整合子，沒有檢出Ⅱ、Ⅲ類整合子。與Yang等[13]分離的牦牛源大腸桿菌中Ⅰ、Ⅱ類整合子檢出率(66%、6%)及陳朝喜等[14]分離的大腸桿菌中Ⅰ、Ⅱ類整合子檢出率(30.50%、18.13%)相比，發現本研究中大腸桿菌Ⅰ類整合子攜帶率更高，同時說明Ⅰ類整合子相比于Ⅱ類整合子更流行。測序分析攜帶Ⅰ類整合子的19株分離菌的可變區，發現有9株分離菌攜帶耐藥基因盒，有3種不同的基因盒排列類型，其中基因盒排列dfrA17-aadA5最為流行，這與李曉娜等[15]和苑曉萌等[16]對大腸桿菌Ⅰ類整合子結構的研究結果相同。對分離株攜帶的Ⅰ類整合子和多重耐藥表型進行分析，發現整合子陽性株的多重耐藥發生率較整合子陰性株更高，與李曉娜等[15]和王海生等[17]的研究結果一致，提示Ⅰ類整合子的存在增強了大腸桿菌的多重耐藥性。

本研究為晉北地區養牛場治療大腸桿菌感染提供了用藥參考，為進一步研究牛源大腸桿菌耐藥性水平傳播機制提供了科學依據。