內蒙古地區奶牛子宮內膜炎致病菌分離鑒定及耐藥性試驗

趙紅霞 , 王曉凱 , 宋 晨 , 郭文瑞 , 郝普國 , 郭 宇 , 呂向聰 , 麻海瀾 , 周偉光 , 樊宏亮

(1.內蒙古農業大學獸醫學院 , 內蒙古 呼和浩特 010010 ; 2.鄂爾多斯生態環境職業學院 , 內蒙古 鄂爾多斯 017000 ; 3.內蒙古動物疫病預防控制中心 , 內蒙古 呼和浩特 010010 ; 4. 內蒙古伊利實業集團股份有限公司 , 內蒙古 呼和浩特 010010)

奶牛子宮內膜炎是奶牛產后常發疾病之一，不僅會引起配種時間推遲、產犢間隔延長和產奶量降低，嚴重時還會導致奶牛屢配不孕，甚至繼發其他疾病或死亡。在歐洲和北美，奶牛子宮內膜炎發生率在9.40%～67.00%，而中國奶牛子宮內膜炎發病率在20%～50%[1]。內蒙古自治區作為我國重要的奶牛養殖優勢區和乳制品加工生產區，奶牛存欄、奶產量均居全國前列，由于飼養管理水平低等眾多因素，奶牛子宮內膜炎的發生率較高，因該病淘汰母牛比例高于50%，給該地區奶牛養殖業帶來嚴重的經濟損失，阻礙其健康發展。

相關研究報道，奶牛子宮內膜炎主要由細菌、真菌、支原體、病毒和寄生蟲引起，細菌是引起該病最主要的病原[2]。其中，以金黃色葡萄球菌、鏈球菌、沙門菌、大腸桿菌、化膿棒狀桿菌和地衣芽孢桿菌最為常見[3]。目前，奶牛子宮內膜炎的治療主要以抗菌藥物為主，由于臨床治療中頻繁地使用甚至是濫用抗菌藥物，導致奶牛源性病原菌耐藥性增強，給該病的防治帶來了更加嚴峻的挑戰。本試驗對引起內蒙古地區奶牛子宮內膜炎的主要病原菌進行分離鑒定，并通過體外藥物敏感試驗測定這些病原菌對常用抗菌藥的敏感性,旨在闡明該地區奶牛子宮內膜炎的感染情況、致病菌的類型及其對常用抗菌藥物的耐藥情況，以期為科學、合理地防治奶牛子宮內膜炎提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 標準菌株ATCC 25923、ATCC 25922和ATCC 49619，均購自中國食品藥品檢定研究院；標準菌株CICC 21482，購自中國獸醫藥品監察所；試驗菌株從呼和浩特周邊奶牛場采集的260份子宮內膜炎病料中分離獲得。

1.2 主要試劑藥品 普通營養瓊脂、伊紅美藍培養基、營養肉湯，均購自北京奧博星生物技術有限責任公司；革蘭染色液、Barid-Parker(B-P)瓊脂培養基、水解酪蛋白肉湯(MH肉湯)、血瓊脂培養基，均購自廣東環凱微生物科技有限公司；SS瓊脂、金黃色葡萄球菌、鏈球菌生化鑒定管、腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；鏈霉素、慶大霉素、青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻呋等44種抗菌藥物標準品，均購自中國獸醫藥品監察所。

1.3 主要儀器 HDL360超凈工作臺，購自哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；HPS-250生化培養箱，購自哈爾濱市東明醫療儀器廠；T6紫外可見光分光光度計，購自北京普析通用儀器有限責任公司。

1.4 病料采集 從呼和浩特市周邊奶牛場選取260例患臨床型子宮內膜炎且未進行藥物治療的病牛，用無菌采樣拭子采集子宮內分泌物，密封后盡快(4 h內)送回實驗室進行細菌分離、鑒定。

1.5 細菌的分離鑒定

1.5.1 細菌的分離培養 將采集的病料在無菌肉湯中進行37 ℃恒溫培養24 h后，分別劃線接種于SS瓊脂平板、含5%脫纖維綿羊血的MH瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板、B-P瓊脂平板，置于37 ℃培養箱中培養24 h。分別挑取4種平板上生長狀態良好的單個典型菌落，進行革蘭染色、鏡檢。根據細菌的菌落形態、生長特性及顯微鏡下細菌的染色和形態特征，對分離菌進行初步鑒定。

1.5.2 分離菌的生化鑒定 將疑似菌分別接種到相應培養基上進行純化，采用細菌生化鑒定管對純化的4種菌進行生化鑒定。4種分離菌的生化鑒定，具體操作參照參考文獻[4-7]報道的試驗方法進行。

1.6 藥敏試驗 采用微量稀釋法，具體操作參照參考文獻[4-7]報道的試驗方法進行。依據美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)2015年推薦的藥敏試驗結果判定標準進行判定。當達到質控要求，且培養液對照孔不長菌，試驗菌株對照孔有細菌生長，而藥液對照孔也無細菌生長時，表明藥敏試驗結果可信，此時可記錄藥敏試驗結果。當“U”型孔底有肉眼可見的細菌生長而形成的圓形斑點時，認為該孔藥物不抑制細菌的生長。而當“U”型孔內清亮、無菌生長時，認為該濃度藥物可抑制細菌的生長，每株菌每種藥物各濃度的3個重復細菌生長情況均一致時，方可記錄結果并確定最小抑菌濃度(MIC)值。將藥敏試驗的結果用敏感(Susceptible)、中介(Intermediate)、耐藥(Resistant)表示。

2 結果

2.1 細菌的分離培養 從260份奶牛子宮內膜炎病料中分離得到的主要病原菌有大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌。4種分離菌的菌株數及檢出率見表1。

表1 260份樣本菌株分離概況Table 1 Bacterial isolates from 260 samples

2.2 4種分離菌的生化鑒定 結果見表2～表5,4種分離菌均符合相應菌種的生化特性。

表2 大腸桿菌的生化鑒定Table 2 Biochemical identification of Escherichia coli

表3 鏈球菌的生化鑒定Table 3 Biochemical identification of Streptococcus

表4 金黃色葡萄球菌的生化鑒定Table 4 Biochemical identification of Staphylococcus aureus

表5 沙門菌的生化鑒定Table 5 Biochemical identification of Salmonella

2.3 4種分離菌的藥敏試驗

2.3.1 大腸桿菌的藥敏試驗 126株大腸桿菌對21種抗菌藥物的藥敏試驗結果見表6，分離菌對磺胺類、芐胺嘧啶類藥物的耐藥率均超過98%;對四環素類的四環素、土霉素的耐藥率達70%以上；對青霉素類的氨芐西林、阿莫西林，氨基糖苷類的卡那霉素、鏈霉素以及四環素類的多西環素、多黏菌素E的耐藥率在50%～60%；對頭孢噻吩、阿米卡星、呋喃唑酮和氟喹諾酮類藥物的耐藥率均在20%～35%，較為敏感;對頭孢噻呋的耐藥率僅為13.7%。

表6 126株大腸桿菌的藥敏試驗Table 6 Drug sensitivity test of 126 Escherichia coli isolates (%)

2.3.2 鏈球菌的藥敏試驗 84株鏈球菌對19種抗菌藥物的藥敏試驗結果見表7，分離菌對四環素、卡那霉素、β-內酰胺類藥物耐藥情況嚴重，耐藥率在80%以上，但對美羅培南的耐藥率較低(47.4%)；對克林霉素、紅霉素、羅紅霉素和慶大霉素的耐藥率在50%～70%；對萬古霉素較為敏感，耐藥率為26.7%；對3種氟喹諾酮類藥物高度敏感，耐藥率在2%～5%。

表7 84株鏈球菌的的藥敏試驗Table 7 Drug sensitivity test of 84 Streptococcus isolates (%)

2.3.3 金黃色葡萄球菌的藥敏試驗 53株金黃色葡萄球菌對16種抗菌藥物和3種組合藥物的藥敏試驗結果見表8，分離菌對β-內酰胺類藥物的耐藥率在60%～85%；對紅霉素、四環素類的四環素、米諾環素、多西環素的耐藥率介于40%～50%；對克林霉素較敏感，耐藥率為37.7%；對氟喹諾酮類藥物的耐藥率在20%～30%；對慶大霉素和3種組合的抗菌藥物的耐藥性弱，耐藥率在7.5%～13.2%；分離菌對萬古霉素完全敏感。

2.3.4 沙門菌的藥敏試驗 21株沙門菌對19種抗菌藥物的藥敏試驗結果見表9，沙門菌對甲氧芐啶和卡那霉素的耐藥率均在90%以上；對慶大霉素、四環素類的土霉素、多西環素和β-內酰胺類藥物的耐藥率均在75%～90%；但對頭孢噻肟較為敏感，耐藥率為29.0%；對氨基糖苷類的阿米卡星和妥布霉素比較敏感，耐藥率低于10%；以上分離菌株未見對4種氟喹諾酮類藥物耐藥。

3 討論

本試驗對內蒙古地區260份奶牛子宮內膜炎病料進行了病原菌的分離鑒定，結果發現引起內蒙古地區奶牛子宮內膜炎的主要致病菌為大腸桿菌(48.5%)、鏈球菌(32.3%)、金黃色葡萄球菌(20.4%)和沙門菌(8.1%)。趙清梅等[8]報道引起寧夏地區奶牛子宮內膜炎的主要致病菌為大腸桿菌(55.56%)、金黃色葡萄球菌(35.9%)，這2種致病菌的分離率均高于本試驗中內蒙古地區奶牛子宮內膜炎致病菌的分離率。李蕊等[9]報道保定市奶牛子宮內膜炎的致病菌主要為金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌，該研究報道的奶牛子宮內膜炎主要致病菌的種類與本試驗結果基本一致。胡文舉等[10]研究發現，河南平頂山地區奶牛子宮內膜炎主要致病菌種類除大腸桿菌外，還有蠟樣芽孢桿菌和奧斯陸莫拉菌等，這可能與奶牛品種、地區不同及飼養管理差異等因素有關。

藥敏試驗結果顯示，4種分離菌對抗菌藥物均產生了不同程度的耐藥性。大腸桿菌和沙門菌對磺胺類藥物具有較高耐藥性，耐藥率高于97%，這可能與臨床中不規范使用此類藥物有關。本試驗結果中，鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌對青霉素類藥物耐藥率均在75%以上，譚春萍等[11]報道的廣西地區引起奶牛子宮內膜炎的致病菌對該類藥物的耐藥率為95.65%，其原因可能與此類治療藥物的長期使用有關。本試驗結果顯示，4種致病菌均對氟喹諾酮類藥物高度敏感，這與郭素風等[12]報道的寧夏地區和麻延峰等[13]報道的金華地區奶牛子宮內膜炎致病菌對氟喹諾酮類藥物敏感情況一致。因此，臨床上推薦使用氟喹諾酮類藥物作為治療奶牛子宮內膜炎疾病的首選藥物。

綜上所述，本試驗對內蒙古地區奶牛子宮內膜炎致病菌的分離、鑒定及藥敏試驗工作可為臨床獸醫人員提供參考，從而提高本病的治愈率。在生產中對于該病應采取綜合防治措施，包括加強飼養管理，定期對環境進行消毒，減少致病菌的傳播；嚴格遵守人工輸精、子宮沖洗等操作規程，及時監測奶牛產后21 d內的子宮復舊情況，及早發現并盡早治療[14]；利用抗菌藥物治療的同時可以使用微生物制劑、激素類藥物、中草藥制劑等共同防治奶牛子宮內膜炎，減少該病對奶牛場造成的經濟損失[15]。