單一或復合益生菌對小鼠免疫機能的影響

黎雨晴，汪澤坤，楊恩東，駱廣財，孫冬冬

（1.安徽農業大學 生命科學學院，安徽合肥 230036；2.安徽亨博士保健食品有限公司，安徽阜陽 236000）

益生菌因對宿主具有多重益處而被認為是抗生素的天然替代品，其功能和作用機制備受關注。隨著各種有益微生物的不斷發現，研究人員對益生菌的生物學特性、功能和安全性進行了詳細的研究[1-4]。研究發現，益生菌在調節腸道菌群、預防慢性病、提高機體免疫力等方面具有一定的作用，是良好的免疫激活劑。其不僅可以改善宿主腸道菌群微生態平衡，還可以改善腸道黏膜表面的屏障功能，以促進免疫細胞的活化和免疫機能的產生，其增強巨噬細胞吞噬功能已廣泛應用于人類和動物保健與疾病防治過程[5-11]。目前，益生菌已經被廣泛應用于各領域中，在人畜保健與某些疾病防治方面發揮著越來越重要的作用。雖然研究已經證實了益生菌具有免疫保護增強的作用[12]，但在益生菌個性化精準補充的倡導下，針對復合益生菌免疫的研究尚不完善。因此，本實驗研究了單一或復合益生菌對小鼠免疫機能的影響，為益生菌微生態制劑產品的合理應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

本實驗所用益生菌包括嗜酸乳桿菌、戊糖乳桿菌、長雙歧桿菌，均來自安徽農業大學生物制藥系。復合益生菌制劑由嗜酸乳桿菌（1×107CFU/g）、戊糖乳桿菌（1×107CFU/g）、長雙歧桿菌（1×107CFU/g）構成。

1.2 試劑與儀器

MRS培養基，FMB級，生工生物工程上海有限公司；莫匹羅星、環丙沙星、氯林可霉素、L-半胱氨酸鹽酸鹽、碳酸鈣、4%多聚甲醛，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；AST等生化試劑盒，北京安普生化有限公司；IL-2等ELISA試劑盒，上海麥克林生化科技有限公司。

GTZ-CJ超凈工作臺，海南龍口有限公司；Allegra 64R臺式冷凍離心機，貝克曼庫爾特國際貿易（上海）有限公司；JM-54R全自動高壓蒸汽滅菌鍋，施都凱儀器設備（上海）有限公司；Multiskan FC酶標儀，賽默飛世爾上海（儀器）有限公司。

1.3 培養基

含X-GAL的BSM培養基（X-BSM）：在MRS培養基（1 L）中加入500 mg的L-半胱氨酸鹽酸鹽、50 mg的莫匹羅星和60 mg的X-GAL。

含碳酸鈣的MRS培養基（Ca-MBS）：MRS培養基（1 L）中添加5 g碳酸鈣。

含環丙沙星-氯林可霉素的MRS培養基（C-MBS）：MRS培養基（1 L）中加入10 mg的環丙沙星和0.1 mg的氯林可霉素。

1.4 實驗動物

本實驗中的SPF級雄性昆明小鼠（體重25～30 g，6周齡）由南京麥瑞斯生物科技有限公司提供。所有動物實驗均按照《實驗動物護理和使用指南》和安徽農業大學實驗動物中心批準的方案進行。

1.5 實驗模型的建立及分組

取SPF級雄性昆明小鼠90只，適應性飼養1周后，隨機抽取15只小鼠繼續普通喂養，作為正常組，剩下的75只小鼠連續三天使用環磷酰胺（60 mg/kg）腹腔注射，期間維持正常的進食進水，制造免疫低下模型。以小鼠出現體形瘦弱、大量脫毛、精神萎靡等現象作為造模成功的標準。造模成功后，將75只造模小鼠隨機分為5組：免疫低下模型組、嗜酸乳桿菌治療組、戊糖乳桿菌治療組、長雙歧桿菌治療組和復合益生菌治療組，每組15只。分別使用單一益生菌制劑（3×107CFU）或復合益生菌制劑（1 g）加入1 g的生理鹽水、對小鼠進行灌胃處理，每天一次，連續灌胃28 d，記錄各組小鼠的體重。

1.6 免疫功能檢測

1.6.1 小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的測定

在小鼠尾部靜脈注入稀釋后的墨汁，分別在注射墨汁后的2 min 和10 min從小鼠眼眶靜脈采血，血液標本用酶標儀測定680 nm處吸光值。小鼠稱重后處死，在超凈工作臺中解剖取出肝臟和脾臟，用生理鹽水洗去表面血污后稱重記錄。按公式（1）和（2）計算碳廓清指數（K）和吞噬指數（α）：

其中，OD1和OD2分別為t1（2 min）和t2（10 min）時刻血液標本的吸光度值，體重、肝重和脾重單位均為g。

1.6.2 免疫器官指數的測定

常規眼球采血后處死小鼠，在超凈工作臺中解剖取出脾臟和胸腺，用生理鹽水洗去表面血污后稱重記錄。按公式（3）和（4）計算脾指數和胸腺指數：

其中，脾重和胸腺重單位為mg，體重單位為g。

1.6.3 小鼠血清生化指標測定

取各組小鼠血清樣本，嚴格按照試劑盒操作規定檢測小鼠血清中谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、血清肌酐（CREA）和尿素氮（UREA）含量。

1.6.4 小鼠血清細胞因子含量測定

血清細胞因子（IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ）含量按照ELISA試劑盒方法進行測定。

1.7 數據處理

實驗數據用均值±標準差表示，SPSS 26.0軟件進行統計學分析，不同實驗組之間的差異分析采用ANOVA，P＜0.05和P＜0.01判斷為差異顯著和差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 單一或復合益生菌對小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的影響

巨噬細胞是一種抗原呈遞細胞，通過分泌細胞因子實現免疫細胞的增殖與分化，提高機體免疫能力[13]。如表1所示，免疫低下模型組小鼠碳廓清指數6.52±0.02，與正常組小鼠碳廓清指數相比下降了13.53%（P＜0.05），說明環磷酰胺使小鼠的單核巨噬細胞吞噬能力下降，表明造模成功；各單一益生菌組（嗜酸乳桿菌組、戊糖乳桿菌組和長雙歧桿菌組）小鼠碳廓清指數與免疫低下模型組相比均顯著升高（P＜0.05），各組分別升高了11.92%、14.81%和16.52%；復合益生菌組小鼠碳廓清指數與免疫低下模型組相比升高了30.91%（P＜0.01）。結果表明，單一或復合益生菌能不同程度提高小鼠的非特異性免疫功能，復合益生菌提高效果更顯著，約為各單一益生菌組的2倍。這一結果表明復合益生菌能有效增強小鼠巨噬細胞的吞噬能力，這可能與益生菌共同作用提高了免疫蛋白的分泌，促使腸黏膜淋巴細胞的增殖，增強了巨噬細胞功能有關[14]。

表1 益生菌對小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的影響

2.2 單一或復合益生菌對小鼠免疫器官指數的影響

免疫器官指數是衡量機體免疫功能的指標之一，其中脾指數和胸腺指數主要反映免疫細胞的功能和免疫器官的發育，間接反映了機體的免疫水平[15]。

如表2所示，免疫低下模型組脾指數（3.98±0.43）mg/g，與正常組相比降低了30.91%（P＜0.01），進一步證明了免疫低下小鼠模型造模成功；嗜酸乳桿菌組、戊糖乳桿菌組和長雙歧桿菌組脾指數分別為（4.43±0.34）mg/g、（4.71±0.72）mg/g 和（4.68±0.56）mg/g，與免疫低下模型組相比均出現了顯著升高（P＜0.05），復合益生菌組更是升高至（6.52±2.47）mg/g，增加了63.82%（P＜ 0.01）。各益生菌處理組與模型組相比，胸腺指數均有所升高，其中戊糖乳桿菌組、長雙歧桿菌組分別升高20.25%和21.52%，復合益生菌組升高了62.66%（P＜0.01）。

表2 益生菌對小鼠免疫器官指數的影響（mg/g）

結果表明，單一或復合益生菌能夠在不同程度上提高免疫低下小鼠的脾指數和胸腺指數，增強免疫低下小鼠脾臟和胸腺的免疫機能，且復合益生菌治療效果更顯著。

2.3 單一或復合益生菌對小鼠血清四項生化指標的影響

如表3所示，免疫低下模型組小鼠與正常組小鼠相比，血清四項生化指標含量均有所升高，其中ALT含量上升了14.49%（P＜0.05），AST、UREA含量分別上升了9.78%和10.58%（P＜0.01），表明造模主要對小鼠的肝功能造成損傷；與免疫低下模型組相比，除嗜酸乳桿菌組小鼠血清中CREA水平無明顯變化、戊糖乳桿菌和長雙歧桿菌組CREA水平顯著上升外，益生菌處理組小鼠血清中AST、ALT、UREA和CREA水平均出現了顯著下降（P＜0.01），且復合益生菌組血清生化指標最接近正常組。

表3 益生菌對小鼠血清生化指標的影響

實驗結果表明，單一或復合益生菌都能夠維持肝腎的正常代謝，有效調節免疫低下模型小鼠的免疫機能，且復合益生菌組的調節效果更顯著。這可能是因為復合益生菌中含有多種營養因子，各種養分和代謝產物均通過血液進行交換，這些因子對生物膜結構有保護作用，復合益生菌營養成分較單一益生菌更多，更能有效改善小鼠胃腸道環境，提高機體免疫功能[16]。

2.4 單一或復合益生菌對小鼠血清細胞因子含量的影響

機體免疫應答中，Th1細胞主要參與細胞免疫，Th2細胞主要參與體液免疫，每種細胞產生的細胞因子相互拮抗，當細胞因子失調，從Th1移向Th2，機體就會處于免疫抑制狀態[17]。

如表4所示，免疫低下模型組血清細胞因子IL-2、IFN-γ分泌水平為（0.61±0.33）ng/mL和（3.31±0.90）ng/mL，分別下降了64.33%和50.74%（P＜0.01）；血清細胞因子IL-4和IL-6分泌水平升高至（7.34±0.81）ng/mL和（10.90±0.63）ng/mL，與正常組相比升高極顯著（P＜0.01）。結果表明，造模后的小鼠Th1型細胞因子含量下降，Th2型細胞因子含量升高，導致機體免疫平衡向Th2的方向移動，抑制了造模小鼠的免疫機能，進一步證明了小鼠模型成功造模。

與免疫低下模型組相比，單一益生菌組血清細胞因子IL-2分泌水平顯著升高（P＜0.05），IFN-γ含量分別增加了1.49倍、1.55倍和1.30倍，分泌水平升高極顯著（P＜0.01）；戊糖乳桿菌和長雙歧桿菌對IL-4和IL-6分泌水平的降低效果極顯著（P＜0.01）；復合益生菌的影響更大（P＜0.01），IL-4、IL-6分泌水平分別下降了41.96%和25.32%，IL-2和IFN-γ分泌水平則分別上升了1.97倍和2.12倍。

表4 益生菌對小鼠血清細胞因子含量的影響（ng/mL）

結果表明，給予造模小鼠益生菌灌胃處理后，單一或復合益生菌組都對血清細胞因子含量產生了不同程度的影響，改善小鼠因造模受到的機體損傷，有效恢復或提高小鼠免疫機能。其中，復合益生菌組比單一益生菌組免疫力改善效果更好。這可能是因為不同益生菌分泌和調節的效應分子不同，這些效應分子相互作用，直接或間接地調節腸道環境，提高機體整體免疫調節能力[18]。

3 結論

以往，研究集中于益生菌作為飼料添加劑發揮保護腸道和促進消化等功能。隨著相關研究的深入，利用生理優勢菌或機體非常駐菌及其代謝產物來預防和治療某些疾病的微生態治療概念被提出[19]。

本研究用環磷酰胺建立免疫低下小鼠模型，分別用單一益生菌（嗜酸乳桿菌、戊糖乳桿菌、長雙歧桿菌）和復合益生菌對小鼠進行灌胃，發現單一益生菌和復合益生菌均能夠顯著提高免疫低下小鼠的非特異性免疫功能，能夠改善小鼠的肝腎功能損傷，且復合益生菌的效果優于單一益生菌。復合益生菌的具體調節機制與劑量、配比和免疫系統自身調節的復雜性有關，有待進一步研究。