噬菌體展示技術開發兔源抗體的工藝優化

孔星

（上海拓興生物科技有限公司，上海 200000）

20世紀80年代，Smith在絲狀噬菌體的pⅢ基因中插入了外源基因，使之可以與pⅢ基因融合，并展示在噬菌體表面，該系統最大的特點即把外源基因和噬菌體scFv聯系在一起，淘選到scFv也就等于淘選到了表達scFv的基因，因此可以利用此技術制備特異性抗體[1]。本文中應用的是絲狀噬菌體展示系統中的pⅢ展示系統，噬菌體scFv在M13KO7輔助下感染大腸桿菌，經過多輪“結合—洗脫—擴增”篩選，可富集到大量特異性的噬菌體抗體，經過免疫學試驗檢測，基因工程方法構建至真核表達載體中，表達出完整的抗體IgG[2]。本文選取CDT1蛋白為研究靶點，CDT1蛋白為DNA復制過程中復制復合體，與其他蛋白一起調節DNA的再復制，因前期采用雜交瘤等技術沒有開發成功，此次選用噬菌體展示技術嘗試開發并對工藝流程進行了優化，具有優化方案有以下兩點[3]。（1）優化了兔源抗體基因序列的擴增引物，通過優化個別堿基以及加入保護堿基，保證了抗體基因庫的完整性和多樣性，以保障足夠的庫容量去淘選特異性抗體。（2）在最后一輪淘選后，噬菌體scFv分樣于96孔板中，并通過增加免疫印跡試驗檢測，對scFv的特異性和親和性進行深入篩選，以提高獲取完整抗體IgG的產率和準確率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多肽，吉爾生化（上海）有限公司合成；引物，鉑尚生物技術（上海）有限公司合成；mRNA提取試劑盒，KR107，天根生化科技（北京）有限公司；Taq酶，KT201，日本Takara公司；pCANTAB5E質粒，上海拓興生物科技有限公司保存，來源于瑞典Amersham公司；2×YT培養基，北京索萊寶科技有限公司；M13KO7輔助噬菌體，美國Thermo Fisher公司；氨芐青霉素和卡那霉素，生工生物工程（上海）股份有限公司；小鼠抗M13-g8p抗體，英國Abcam公司；FreeStyle?293表達系統，美國Thermo Fisher公司；MabSelect SuRe蛋白A層析填料，美國GE Healthcare公司。

1.2 儀器與設備

EDC-810型PCR儀，北京東勝創新生物科技有限公司；Multiskan FC型酶標儀，美國Thermo Fisher公司；X1R型離心機，美國Thermo Fisher公司。

1.3 制備scFv基因庫

以CDT1蛋白（蛋白號：Q9H211）設計抗原序列（CHITARLAHQTRAEEGL）免疫兔子。5次免疫，確定抗體有效價后，血液及脾臟里的B淋巴細胞均作為模板提取mRNA。分子生物學操作技術均參照《醫學分子生物學實驗技術》[4]。

本文對所使用的引物分兩次設計。首先根據已有的兔源抗體基因以及上傳至NCBI上的序列作序列比對，在恒定區域內找出完全一致的序列區域，在區域內隨機截取了10段序列作引物作首次擴增引物測試，滿足引物的設計標準，在PCR結果中選取最干凈最亮的作為備選引物，在這對引物的基礎之上，刪減或增加堿基以及添加保護堿基來增加引物擴增效率。根據所設計的引物，重鏈引物名稱為HCF1、HCR1，輕鏈引物名稱為LCF1、LCR1，進行首次擴增，以上述DNA片段為模板再次設計引物。用100種已知序列的DNA序列作為模板，用第1次設計的引物擴增，PCR結果送去測序，以此來驗證引物擴增效率。第2次分別擴增出VH和VL（重鏈和輕鏈的可變區域），重鏈引物名稱為HCF2、HCR2；輕鏈引物名稱為LCF2、LCR2。PCR擴增程序：95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，60 s；40個循環，分別回收DNA片段。第3次PCR擴增無需引物，以第2次擴增獲得的VH和VL基因為模板，PCR擴增程序與上述一致，擴增出帶有SfiI和NotI酶切位點的VH-VL片段（中間含linker），隨后插入到準備好的pCANTAB 5E載體中，成為scFv文庫。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 噬菌體表面展示文庫的構建

為了最大化地擴充庫容量，將上述構建的scFv基因庫多次轉化TG1感受態細胞，次日用細胞刮刀刮下LB（Luria-Bertani Broth）固體瓊脂板上所有的菌落，接入含有氨芐青霉素的50 mL 2×YT培養基中，37 ℃培養3 h至對數期，此時可以表達F性鞭毛。加入M13KO7（1×1011pfu/mL），37 ℃培養 1 h，14 000 r/min離心10 min，重懸沉淀于200 mL 2×YT培養基中（含有氨芐青霉素和卡那霉素），37 ℃過夜培養。將過夜的培養液14 000 r/min離心15 min，200 mL的上清加入 50 mL PEG/NaCl（20%PEG-8 000，2.5 mol/L NaCl）溶液并放置于冰上1 h。14 000 r/min離心30 min，倒掉上清。用5 mL PBS懸浮沉淀，即得噬菌體scFv文庫。將所得文庫做梯度稀釋 1×10-4、1×10-6、1×10-8、1×10-10和1×10-12，測定噬菌體scFv文庫的滴度。

1.5 特異性scFv的篩選

將CDT1蛋白的抗原溶于PBS溶液里，包被在高親和力細胞培養皿中，為淘選到親和力高的scFv，后兩輪的包被抗原量逐漸降低。次日加牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）封閉，洗去封閉液后加入上述步驟的噬菌體scFv文庫，室溫孵育2 h，用含吐溫的PBS溶液洗掉未結合的噬菌體（每一輪漂洗20次），用100 mmol/L TAE（Tris-Acetic-EDTA）緩沖液洗脫結合在抗原上的噬菌體，溶于Tris-HCl緩沖液后再次感染處于對數生長期的TG1細胞，取小樣稀釋一定的梯度測定被洗脫出來噬菌體侵染的細菌個數（測定滴度）。對數生長期的TG1細胞培養3 h后，經M13KO7超感染，次日離心回收上清，通過沉淀、吸附以及洗脫得到重組噬菌體抗體次級庫并測定其滴度（具體步驟同噬菌體表面展示文庫的構建）。重復吸附-洗脫-擴增過程3次,得到富含對CDT1蛋白有親和性的噬菌體scFv抗體四級庫。對每一輪篩選均測定文庫滴度以及富集率，作為特異性噬菌體scFv富集的指標，富集率的計算公式如下：

1.6 特異性scFv的檢測

上述噬菌體scFv抗體四級庫，取50%低溫保存于甘油中，剩余的在M13KO7輔助感染下，產生五級庫。上清液稀釋在96孔高親和力酶標板中，取少量上清液做酶聯免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）檢測，上清加入到包被多肽的酶標板中反應1 h，PBST（PBS-Tween-20）洗滌3次,加入小鼠抗M13-g8p抗體和HRP標記羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h，經底物TMB（四甲基聯苯胺）顯色后，于波長450 nm測定OD值，高于陰性值5倍的視為陽性。選擇293細胞作免疫印跡試驗樣本，隨機挑選上述OD值最高的10孔檢測，加入小鼠抗M13-g8p抗體和HRP標記羊抗小鼠二抗，室溫孵育2 h，經ECL發光底物曝光，有主帶的視為陽性，記下陽性孔的編號。免疫學操作均參照《免疫學技術及其應用》[5]。

1.7 完整抗體的表達和檢測

上述步驟的陽性孔的噬菌體感染處于對數生長期的TG1細胞，鋪于瓊脂板上過夜，第二天挑取10個菌落，接種于2×TY培養基中，37 ℃培養3 h，取2 μL作為模板，分別擴增重鏈和輕鏈，回收DNA片段后插入到準備好的真核表達載體中（包含抗體恒定區），酶切鑒定質粒正確后轉入生產。抗體生產體系使用FreeStyle?系統。細胞上清液用Protein A親和純化抗體。抗體保存于PBS緩沖液中，濃度定在1 mg/mL。選擇HeLa細胞作為免疫熒光試驗樣本，使用帶有FITC的二抗，二抗稀釋比例參照使用說明書。

2 結果與分析

2.1 scFv基因庫的構建

用已知的100種DNA序列作模板，通過PCR第一次擴增，測序結果顯示，擴增準確率為100%。兩次PCR擴增出抗體的VH和VL，VH長度在370 bp，VL長度在380 bp，連接后的VH-linker-VL長度在750 bp，連入載體后，經過酶切鑒定，條帶位置正確。

2.2 噬菌體表面展示文庫滴度測定

為了便于試驗操作和計算，把每一輪的投入克隆數都調成8×1012。表2顯示每一輪的富集率是逐漸提高的，為了提高淘選的親和力，后兩輪的包被抗原量逐漸減少，洗脫下來的噬菌體scFv滴度明顯增加，第4輪富集率為第1輪富集率的80倍，表明在淘選過程中噬菌體scFv得到很大程度富集。

表2 滴度測定和富集率

2.3 特異性噬菌體scFv的鑒定

經ELISA檢測后，有10孔以上的陽性孔，表明噬菌體scFv具有特異性和親和力。挑選OD值高的孔做免疫印跡試驗。圖1為選取其中一孔的試驗結果，箭頭處即為蛋白位置，與生物信息學預測相一致。圖中總體稀釋比偏低，且有雜帶，與單鏈抗體只有一個識別區域有關系，與完整抗體相比，scFv的特異性相差無幾，但是親和力不足，如果將此scFv轉換成完整抗體后，特異性不變，親和力增加，就可以證明scFv轉換成完整抗體是成功的。

圖1 scFv免疫印跡試驗結果

2.4 完整抗體免疫學試驗

將上述scFv用PCR方法轉換成完整抗體后，經酶切鑒定，插入片段大小正確。通過真核表達系統生產，親和純化后，ELISA檢測后確定有特異性完整抗體。用HeLa細胞作樣本，進行免疫熒光試驗，圖2顯示蛋白定位于細胞核中，與生物信息學預測相一致；每個細胞均與抗體結合上，顏色較亮（DAPI染色HeLa細胞核顯藍色，FITC標記的二抗顯綠色），表明親和力較高，證明了此scFv轉換成完整抗體是成功的。

圖2 完整抗體免疫熒光試驗

3 結論

本文概述了噬菌體展示技術篩選兔源抗體的工藝流程，其中包括兩方面優化方案。優化后的方案，首先在建文庫階段就最大化地囊括了抗體基因，讓篩選到特異性抗體的概率大大提高；其次在檢測階段加入了免疫印跡試驗，相當于進一步地去篩選特異性抗體，讓scFv轉換成完整抗體后，抗體檢測時成功率更高。此方案繞過了雜交瘤等傳統方法，直接獲得抗體基因，但是想要擴增出所有的抗體基因，還需要對引物持續優化改造。

該方案成功運用噬菌體展示技術篩選到了具有特異性和親和力的兔源單克隆抗體，但同時存在不足不處，科研工作者可以從生物體內淘選到特異性的scFv，因為工作需求還需將此scFv轉換成完整抗體IgG，但是從結構和功能上來看，scFv與完整抗體IgG是有差異的，scFv不能等同于完整抗體。這就造成了淘選到的scFv最后轉換成完整抗體時，檢測結果與scFv階段不一樣，甚至特異性都發生了變化，造成轉換后的完整抗體IgG不能使用。出現這種情況，只能再次篩選保存起來的scFv文庫或者宣告試驗失敗，增加了時間和試驗成本。因此就目前來看，此方案暫時還不能做為單克隆抗體篩選的主要方式，可以作為備選方案。當傳統方法沒有篩選到特異性的抗體，可以用備份的脾臟或血液嘗試噬菌體展示技術，篩選特異性抗體。