EasyDisc與傳統平皿計數法檢測水中菌落總數的比較

周東海，趙旭坤，王晉宇，郭志宇，楊燁

（1.蘇州蘇水環境監測服務有限公司，江蘇蘇州 215131；2.愛德士緬因生物制品貿易（上海）有限公司，上海 200336）

近些年，人們對生活品質的追求越來越高，生活飲用水品質提升的呼聲不斷，上海和深圳分別發布了地方《生活飲用水水質標準》（DB31/T 1091—2018）和（DB4403/T 60—2020），其產品指標的數目和要求與2006年原衛生部發布的《生活飲用水衛生標準》（GB 5749—2006）均有一定的提升，其中表征水體微生物污染程度的菌落總數限值均由100 CFU/mL調整為50 CFU/mL。目前測定水中菌落總數的標準方法主要為傳統的平皿計數法，即用營養瓊脂培養基在36～37 ℃有氧靜置培養48 h然后計數，由于該方法的培養條件限制，部分已被證實存在于水體中的有害細菌，如弧菌（Vibrio）、沙門氏菌（Salmonella）等，難以在此條件下生長，導致檢測值偏低[1-2]。同時該方法存在諸如培養基配制、滅菌等步驟多，操作過程易引入污染，對檢測環境要求高，結果讀數耗時且人工讀數誤差大等不足，不能滿足實驗室大宗樣品的快速檢測和突發應急檢測的需求，雖然該方法在近期有一定更新，但是其原理和操作步驟并沒有顯著變化[3]。水中菌落總數檢測的酶底物法（EPA9215），已于2013年寫入廣東省地方標準《水中菌落總數復合酶底物檢測方法》（DB44/T 1163—2013），同時該方法已經在《生活飲用水標準檢驗方法》（GB/T 5750）征求意見稿中進行了公示，可以認為是相對成熟的方法。其他菌落總數檢測方法如定量盤檢測法（HPC for Quanti-tray）[4]或者ATP檢測法[5]，存在樣品取樣量大或耗材不易保存等缺點，均未得到大面積推廣。

EasyDisc法是一種檢測水中菌落總數的新方法，基本原理是EasyDisc內置了添加顯色底物的脫水PCA培養基，微生物在此培養基上能代謝生成特異性酶，促進顯色底物反應生成藍色物質，方便計數[6]。操作時僅需要將1 mL樣品加入EasyDisc平皿，水平搖晃使樣品均勻分布，室溫下靜置后放入36 ℃培養箱培養。與傳統平皿計數法相比，該法無需煩瑣的人工配制培養基環節，操作時間短，顯著降低檢測流程可能引入的污染。本文使用EasyDisc法和傳統平皿計數法，同時檢測NSI質控樣和蘇州地區供水生產和供水管網樣品中的菌落總數，并將檢測結果進行了比較和分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

平板計數瓊脂（PCA）、營養肉湯培養基（NB），北京陸橋技術股份有限公司；定性標準菌株大腸埃希氏菌和腸球菌，中國工業微生物菌種保藏中心；硫代硫酸鈉，國產分析純，配制0.1 mol/L溶液，高壓蒸汽滅菌備用；EasyDisc試劑、NSI質控樣、無菌磷酸緩沖液，美國IDEXX公司；水樣品，蘇州地區X水廠水源水和出廠水，X水廠對應供水管網的末梢水和二次供水；樣品采集和保存參照《生活飲用水標準檢驗方法 水樣的采集和保存》（GB/T 5750.2—2006）進行；上海森信GRP-9050隔水式恒溫培養箱，控溫精度達到0.5 ℃，經權威計量測試機構計量合格。

1.2 實驗方法

1.2.1 平皿計數法

參照標準方法《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》（GB/T 5750.12—2006）（1.1）進行檢測，將方法中的營養瓊脂培養基（NA）替換成平板計數瓊脂（PCA）。

1.2.2 EasyDisc法

取下EasyDisc蓋子，向平皿中加入1 mL樣品，輕輕回旋平皿，使樣品均勻遍布于整個平皿，室溫靜置20 min后放入36 ℃培養箱中培養（48±3）h。

1.2.3 NSI質控樣使用方法

將質控樣從冷藏箱中取出，室溫平衡15 min后全部移入100 mL無菌磷酸緩沖液中，溶解后30 min內使用。

1.2.4 其他定性標準菌株使用方法

按照說明書復壯后，接入營養肉湯（NB），振蕩培養24 h得到菌懸液，使用無菌磷酸緩沖液梯度稀釋103、104倍，獲得不同濃度的菌懸液備用。

2 結果與分析

2.1 NSI質控樣檢測結果分析

按照1.2.3方法的準備質控樣，按照1.2.1和1.2.2分別采用兩種方法對其進行檢測，檢測結果見表1和圖1，可以發現平皿計數法和EasyDisc法檢測NSI質控樣，其結果均在其可接受范圍內。

表1 EasyDisc和平皿計數法檢測NSI質控樣的結果

圖1 EasyDisc和平皿計數法檢測圖片

2.2 實際樣品檢測結果分析

選取蘇州地區40個實際樣品，采用2種方法進行檢測，結果見表2。傳統平皿計數法和EasyDisc法具有相近的實驗結果，適用于該地區水中菌落總數的檢測。

表2 EasyDisc和平皿計數法檢測蘇州地區實際樣品的結果

選取蘇州地區1個出廠水樣品和1個管網水樣品，采用硫代硫酸鈉脫氯后，分別加入采用1.2.4方法制備得到的大腸埃希氏菌、腸球菌及兩種菌的混合懸液，檢測結果如表3所示。

表3 EasyDisc和平皿計數法檢測蘇州地區出廠水和管網水加標樣品的結果

對表2中水源水數據和表3中所有數據進行EasyDisc和平皿計數法檢測結果的配對t檢驗，由于微生物的檢測數據結果屬于偏態分布，對其以10取對數計算后再進行t檢驗[7]，結果P=0.058＞0.05，說明2種方法不存在顯著性差異，可以認為EasyDisc和平皿計數法的實驗結果具有一致性，均可有效檢測水中的菌落總數。大腸埃希氏菌和腸球菌可分別代表腸道微生物中的革蘭氏陰性和陽性菌，通過實驗可以發現采用EasyDisc檢測兩個菌種加標樣品和平皿計數法并無明顯差異，并且混合菌種檢測并未見顯著競爭抑制現象，可以認為EasyDisc在檢測水源水和生活飲用水樣品中具有一定的普適性。

3 結語

EasyDisc是檢測水中菌落總數的新方法，與傳統平皿計數法相比，從比對數據結果上看未發現明顯差異。EasyDisc法具有操作便捷、結果清晰、環境需求低、讀數誤差少等明顯優點，能夠為實驗室便捷檢測水中菌落總數提供支持，一定程度上提高了檢測效率。由于EasyDisc法測定水中菌落總數還未有相關正式檢測標準方法，且該法檢測成本相對于平皿計數法略高，因此可作為傳統平皿計數法的補充方法。同時考慮EasyDisc法操作快速簡單，在各類應急突發檢測方面也有很大的前景，有望成為水中菌落總數快速便捷檢測法的一種。