皮質類固醇結合球蛋白的肝外表達研究進展

張雨欣，王暢

（煙臺大學 藥學院，山東煙臺 264005）

皮質類固醇結合球蛋白（Corticosteroid-Binding Globulin，CBG），又稱轉皮質素（transcortin），1956年，DAUGHADAY通過平衡透析法首次發現；1961年，SEAL和DOE首次獲得純化CBG；20世界90年代起，在許多物種中對其進行克隆和表征[1]。CBG是一種與類固醇激素密切相關的單體糖蛋白，主要由肝臟合成，分泌入血調節皮質醇（CORT）的濃度，在皮質醇分泌高峰時起到緩沖作用，當局部出現炎癥時，CBG作為皮質醇的儲庫又可快速釋放大量皮質醇，發揮抗炎作用。已有證據表明，CBG廣泛分布在不同組織中，肝臟不是CBG的唯一合成場所[2]。但其在組織中的功能是否同經典血液學功能一致，是否存在特異性的其他相關功能值得深入探究。本文簡述了CBG的特點及其經典血液學功能，并總結了CBG在肝外組織中表達及功能的研究進展。

1 CBG簡介

CBG由405個氨基酸殘基組成，一級結構分子量約42 kDa，有6個N-糖基化位點，其中Asn347糖化為其發揮結合活性所必需[3]，非糖基化CBG結合皮質醇的能力比正常CBG低約60%[4]。CBG屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpin）超家族成員，與該家族中的抗胰蛋白酶（ATT）有40%以上的結構同源性[5]，具有serpin典型的三維結構特征：（1）包括三個β-折疊（A、B、C）、九個α-螺旋（hA～hI）、一個反應中心環（RCL），其中β-折疊B、α-螺旋hH和α-螺旋hA構成CBG的皮質醇結合口袋，RCL為中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）的結合靶標；（2）在生理條件下CBG有R構象（Relaxed Conformation）與S構象（Stressed Conformation）兩種狀態，當NE插入到裸露RCL的Val344和Thr345之間，破壞皮質醇結合位點，S構象不可逆地轉換成R構象，hD解螺旋，則大量皮質醇瞬時釋放發揮局部抗炎作用。其中，S構象CBG與皮質醇的結合力高，又稱為高親和力CBG（ha CBG），R構象CBG又稱低親和力CBG（la CBG）[6-8]。

糖皮質激素（GCs）并不是CBG的唯一配體，性激素（SH）、鹽皮質激素（MCs）等也可與CBG結合，且結合特征具有物種差異性[9]：人CBG與類固醇激素結合能力為皮質醇＞皮質酮＞17-羥基孕酮＞孕酮＞可的松＞醛固酮，幾乎不結合雄激素[10]；而鳥類沒有性激素結合球蛋白，CBG能以高親和力結合雄激素[9,11]。

2 影響CBG變化的因素

在生理狀態下，人血CBG的循環濃度在30～52 pg/mL，呈晝夜節律變化，18:00濃度最高，03:00左右濃度最低[12]。妊娠期受到雌激素的影響，隨孕齡增加，CBG逐漸增加，妊娠末期可達正常的兩倍。為了確保皮質醇運輸至胎兒組織，其在合體滋養細胞膜的親和力較正常狀態CBG高約60倍，稱作“妊娠特異性CBG”，能以高親和力與孕酮結合，影響外周血和母-胎界面的孕酮水平[13-14]。在病理狀態下，CBG的變化多伴隨GCs異常。例如，多發性創傷患者的游離皮質醇減少、CBG增加；敗血癥、燒傷、感染性休克、糖尿病患者的游離皮質醇增加，CBG水平降低；在膿毒血癥中，血漿中的CBG水平可迅速減少50%，從而增加游離的皮質醇水平，進而放大下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的激活效應。因此，一般認為CBG是一種負性調控的急性期反應物[10]。目前已發現4種遺傳性CBG突變：CBG Leuven和CBG Lyon患者的皮質醇結合力降低70%～75%，CBG 0患者的CBG全缺失，CBG Santiago患者的晨時皮質醇及促腎上腺皮質激素（ACTH）刺激下的峰值皮質醇水平均降低。CBG功能缺陷的診斷和生理后果仍不明確，突變患者可能會表現出慢性疼痛、低血壓、疲累、偏頭痛、抑郁等腎上腺功能不全的癥狀，但并不完全相關[5,15]。

白介素-6（IL-6）是早期炎癥反應的重要促炎細胞因子，能夠在轉錄水平抑制CBG的合成[16]，且CBG基因啟動子中存在IL-6的響應元件[17]。在HepG2細胞中觀察到胰島素及胰島素樣因子（IGF-1）能夠抑制CBG的合成與分泌[18]。人體試驗發現，胰島素對CBG的抑制效應與糖耐受及體脂等個體因素有關：在超重和肥胖成人中，肥胖的耐葡萄糖受試者表現出強烈的血清CBG抑制效應；相反，在體脂率低的成人中胰島素分泌越高，血清CBG濃度越低[19]。口服避孕藥（如炔雌醇）能夠增加CBG的合成，其與雌激素α受體有關[20]；腎上腺皮質類藥物米托坦同樣可以增加CBG的合成[21]。甲狀腺激素能夠提高基礎代謝率，研究表明，內源和外源性甲狀腺激素降低人血漿CBG水平，甲狀腺激素對CBG生物合成的抑制作用可能有助于維持血漿葡萄糖水平，以滿足由激素升高引起的代謝需求增加；但不同體外研究結果存在差異，可能與試驗方法有關[22]。在生理范圍內，皮質醇與CBG的結合對溫度變化非常敏感，親和力隨溫度升高而明顯減小，HENLEY和LIGHTMAN發現，在35～42℃內，CBG會在發燒或外部熱源刺激下釋放皮質醇，但對生理范圍內的pH變化不敏感[23]。

3 CBG的經典功能

經典的CBG功能為由肝臟合成并分泌入血，發揮皮質醇儲庫及運輸的作用。血漿中白蛋白與CBG含量比約為775∶1，37 ℃下CBG與皮質醇的結合常數為3×107L/mol，而白蛋白主要結合人工合成的皮質激素、MCs等，與皮質醇親和力低，結合常數為0.5×104L/mol[24-27]。生理狀態下，血漿游離皮質醇含量小于血漿皮質醇總量的8%，有80%～90%的循環血皮質醇呈蛋白結合態[28-30]；當局部組織有炎癥發生時，攜帶皮質醇的CBG在炎癥部位聚集，在NE的作用下ha CBG轉換為la CBG[31]，或者由胰凝乳蛋白酶將反應中心環上的兩個亮氨酸殘基裂解[32]，從而局部釋放大量皮質醇，進入細胞發揮抗炎作用。

CBG經典功能如圖1所示，黑色圓圈代表的生理過程分別為：（1）游離皮質醇擴散到細胞中，調節細胞內生理活動；（2）循環中，15%的皮質醇以低親和力與多含量白蛋白結合；（3）高親和力CBG構成皮質醇儲庫，有針對性地將皮質醇輸送到炎癥部位；蛋白水解酶（如中性粒細胞分泌的中性粒細胞彈性酶）裂解CBG，降低皮質醇結合的親和力并釋放出皮質醇；（4）CBG對溫度變化敏感，結合親和力降低，少量釋放皮質醇；（5）低親和力CBG仍能部分結合皮質醇，作為重要的動態緩沖器；（6）皮質醇結合的CBG可能與特定的受體結合；（7）CBG mRNA在細胞內定位，可能調節皮質醇進出特定細胞。

圖1 CBG經典功能

目前，人們對血CBG的作用闡釋可分為總激素、游離激素和結合激素三種經典假說[33]，MALISCH和SATTERLEE[34]提出的儲庫假說可視為對游離激素假說的進一步闡述。（1）總激素假說：該假說認為血漿中的所有激素（結合態和游離態）均可自由進入組織，結合相應受體發揮效應，即100%的血漿類固醇具有生物活性，水溶性的CBG結合脂溶性激素主要發揮載體功能[35]。（2）游離激素假說：生理條件下，CBG大小通常為50～60 kDa，同CBG結合的激素均無法自由進入組織液，只有游離態激素能夠發揮生物活性[10]。儲庫假說認為，不僅游離激素具有生物學活性，類固醇激素-CBG復合物同樣具有其他生物學活性，血漿中與激素結合的CBG可作為儲庫，當CBG的含量或結合親和力下降時，釋放結合激素發揮生物活性，CBG的節律變化即為儲庫假說的有力證據[36]。（3）結合激素假說：該假說同樣認為類固醇激素-CBG復合物有生物學活性，并猜想細胞膜上存在相應的CORT-CBG結合受體，CORT-CBG復合物與受體結合發揮直接或間接效應。此猜想主要建立在對腦內CBG研究的基礎上，但未有實驗性證據，作者認為若能夠在脈管系統中發現相關的膜轉運蛋白，且影響細胞外CBG結合激素的功能時，結合激素假說或許將有實質性突破[37]。

4 CBG在肝外組織中的分布

4.1 CBG在腦內的表達

1984年，在人腦脊液（CSF）中發現有濃度低于血漿的CBG存在[38-39]，但不能確定其來源；2006年，MOPERT等[40]第一次在大鼠下丘腦中檢測出CBG；隨后，人們發現CBG在不同腦區、不同神經細胞群（神經元和神經膠質細胞）中廣泛分布，在大鼠和小鼠腦中的伏隔核、丘腦、中隔、海馬、蒼白球、杏仁核、布羅卡斯區及大腦皮層等區域均有CBG的表達[41-43]；此外，發現下丘腦含有編碼CBG的mRNA，且全序列測定結果顯示，CBG的下丘腦cDNA與肝臟完全一致[41]，由于大小限制CBG不能通過血腦屏障。以上這些研究共同說明腦組織能夠自身生成CBG。

中樞CBG廣泛分布很可能具有某些特殊功能，并且與GCs密切相關。下丘腦中的CBG與神經腦垂體激素-加壓素和催產素共定位，用秋水仙堿預處理后CBG的免疫反應性增加，說明CBG可隨兩種激素一同沿細胞軸突在軸漿中向末梢流動，釋放到體循環中，即CBG很可能參與了HPA軸中的某一環節[44]。特異性敲除CBG基因的小鼠在應激期間能夠觀察到絕望行為和記憶變化，表現出更多的抑郁樣行為學特征，這種特異性的神經變化表明CBG可能不僅局限于參與炎癥反應，在情緒調控中也有重要作用。熒光分析發現腦內CBG與糖皮質激素受體不處同一位置，可能某些神經元中產生的CBG能將糖皮質激素輸送到無糖皮質激素受體的細胞中，即CBG可能參與了中樞類固醇激素的非基因組作用機制[45]。

4.2 CBG在心臟的表達

RT-PCR表明，人心肌細胞能夠自主合成CBG，且擴增大小同肝臟CBG相同；熒光染色結果顯示，CBG在近乎所有心肌細胞質中有免疫反應性，其在浦肯野纖維中的免疫原性最強，在細胞膜、血管內皮細胞、心肌動脈壁上的平滑肌細胞及心內膜細胞核中也有較強的熒光反應；熒光共定位實驗顯示，CBG與鹽皮質激素受體（MR）共定位[46]。

CBG能夠與GCs、MCs結合，因此心肌CBG可能發揮同血漿CBG類似的緩沖作用，能夠調控激素釋放，平衡GCs和MCs水平，起到心肌保護作用。心肌細胞中糖皮質激素受體（GR）含量低，GCs主要同核MR結合發揮慢效應[47-48]；CBG與MR共定位，可能作為激素與受體結合前的中間介質，起到傳遞類固醇激素的連接作用。浦肯野纖維是一種特化的心肌細胞，能夠快速有效地傳導心臟動作電位，協調心臟收縮，且與心律失常、心源性猝死等疾病的發生密切相關。已有研究證明，長期應激與心律失常的發生有關，CBG在該處的強免疫原性提示其可能參與了心臟傳導系統功能[49]。類固醇激素及其受體與心血管系統的作用復雜，近年來的研究認為，GCs存在另外的獨立于核受體的快速非基因組效應，但具體機制未明；心肌細胞膜上檢測到有CBG的免疫原性，因此猜測存在CBG的膜受體，可與配體GC-CBG復合物結合，發揮快速非基因組效應[23,50]。

4.3 CBG在睪丸的表達

1987年，HAMMOND等[37]通過Northern blotting方法發現睪丸組織中有低水平的CBG表達；SUN等通過RNA熒光原位雜交（FISH）首次證實了CBG在睪丸間質細胞中特異性表達；過表達CBG后，與類固醇合成相關的四種蛋白（StAR，CYP11A1，CYP17A1和3β-HSD）上調；敲低CBG后細胞孕激素水平顯著下降，與類固醇激素合成相關的蛋白質水平也相應降低；黃體生成素（LH）通過G蛋白偶聯受體介導的信號通路調控性激素的合成，研究顯示LH能夠刺激細胞產生及分泌CBG，提示CBG在睪丸間質細胞中的表達可能與性激素的合成有關；蛋白印跡結果顯示，在小鼠睪丸中觀察到CBG的兩種電泳亞型，表明CBG具有糖基化異質性[51]。糖代謝組學研究認為，CBG在不同生理狀態下N-糖基化的程度不同，不同的糖基化方式可能影響CBG的折疊、分泌、半衰期及對類固醇激素的靶向作用，并影響其生物學功能[52]。這些研究為CBG發揮細胞組織內的激素轉運體作用假說提供了依據，睪丸間質細胞CBG的特異性表達在睪酮合成、分泌等過程中的作用值得進一步探索。

4.4 CBG在白色脂肪組織的表達

白色脂肪組織（WAT）是儲存能量的主要部位，也是GCs的主要靶組織。del MAR GRASA等[53]在WAT質膜細胞周圍的薄層中發現有CBG表達，卵巢周圍的WAT中有CBG的mRNA，證明WAT能夠產生CBG，但合成能力遠小于肝臟。GULFO等[54]發現，在脂質過量的情況下，CBG缺乏會促使脂質從皮下脂肪分配到內臟脂肪庫，并影響Ⅱ型11β-羥基類固醇脫氫酶（一種控制糖皮質激素發揮活性的酶）的表達。

針對CBG包被分布在WAT細胞周圍發揮何種功能，有如下猜想[53]。（1）可能作為一種保護性屏障，通過結合親和力與含量的變化調節這種“門控”作用，抑制GCs與脂肪細胞的識別結合，限制GCs進入脂肪細胞。（2）游離脂肪酸與CBG結合可能調控了CBG與皮質酮的結合能力。脂肪細胞內GCs與受體結合會引起脂解反應，釋放非酯化脂肪酸進入間隙后入血，較高濃度的不飽和脂肪酸增強皮質酮與CBG的結合力，但飽和脂酸降低二者結合力。（3）“CBG層”可能構成調節GCs作用于白色脂肪細胞的反饋環，并且通過改變CBG的合成及內化速率來加強這種反饋調節。這些猜想認為WAT周圍的CBG環是一種保護系統，在脂肪分解加強的情況下降低WAT對GCs的敏感性，以減少不必要的脂肪儲備[55]。

肥胖者的應激反應往往更強，且HPA軸的功能通常發生改變，其中GCs是肥胖發生和維持的重要因素。OUSOVA等[56]提出，CBG基因是皮質醇水平和肥胖易感性的關鍵調節因子，人血漿CBG水平被視為胰島素分泌的標志物，胰島素能夠抑制CBG的表達，且CBG與胰島素抵抗密切相關[18,57-58]。因此，CBG很可能在GCs驅動下的代謝紊亂中有重要作用[59]。

5 CBG在肝外組織表達的功能

除了上述提到的組織外，CBG在肺、子宮內膜、胎盤、腎上腺、腎臟等組織器官中也表達[60-64]。CBG在不同組織中的表達可能發揮某些同類功能。（1）膜受體：使用高純度的125I-CBG作為探針，發現CBG與由人前列腺組織制備的膜有特異性結合，且這種結合是時間和溫度依賴性的（與37 ℃相比，在4 ℃和23 ℃時的結合可以忽略不計），Ca2+與Mg2+是結合的必要條件，其他血漿蛋白不結合該膜受體[37]。在其他組織膜上也得到了類似的結果，如孕酮-CBG復合物能夠特異性結合人的子宮內膜[65]；在人肝細胞的質膜中發現了識別和特異性結合天然CBG-皮質醇復合物的結合位點[66-67]；胎盤細胞質膜上也有CBG的特異性結合位點，且膜結合受糖蛋白分子構象及其碳水化合物鏈結構的影響[68]；在心肌細胞膜上有明顯的CBG免疫反應性[46]。這種特異性的CBG膜受體可能有著激活第二信使、內化CBG-類固醇激素復合物、釋放用于局部遞送的類固醇、介導GCs的快速非基因組效應等作用[69]。（2）生物標志物：血液CBG作為急性期蛋白，其變化（特別是CBG的蛋白水解）可作為炎癥早期癥狀發生前和炎癥發作嚴重程度的重要生物標志物[70]。此外，心肌CBG在預測心血管風險、腦脊液CBG在預測壓力相關抑郁癥風險、遺傳變異CBG在識別慢性疲勞綜合癥風險以及監測潛在有類固醇過量風險等診斷中可能具有重要價值[49]。（3）性別二態性：在腎上腺、肺等中發現與肝臟相反的CBG二態性[62,65]，在糖耐受實驗中發現CBG的表達具有性別二態性，女性表現出較低的CBG水平，且與高脂肪含量呈更強的相關性[71-72]。

6 結語

CBG在多種組織中有表達，除了經典的血漿作用外，已有大量有關其組織特異性效應的報道，但是有關CBG在組織中廣泛分布的真正生理意義的報道很少。本文總結了CBG的相關背景及其肝外組織表達研究進展，CBG在局部炎癥應激反應、GCs水平調控、孕酮轉運、能量代謝等過程中很可能充當重要角色，針對CBG如何選擇性結合GCs和MCs、CBG是否參與到GCs的非基因組途徑、CBG的膜受體存在的共有或特異功能等問題仍有很大挖掘潛力。因此，可從多角度著手，以GCs在某個組織的作用為出發點，結合不同組織的特異性功能及病理生理學特征，進一步探索CBG的功能。