槲皮素通過抑制TGF-β/TAK1/JNK和TGF-β/Smad2信號通路發(fā)揮抗肝纖維化的作用

王紹展，王媛媛，顧妍秋，陳春，李勝男，王蓉，原永芳（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科，上海 201999）

肝纖維化是各種慢性刺激或病因所致肝組織中細胞外基質(zhì)（ECM）的過度增生和沉積，是一種可逆性的肝損傷修復(fù)反應(yīng)，繼續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌。大量研究表明，肝星狀細胞的活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[1-2]，在促纖維化因子作用下，激活的肝星狀細胞急劇增殖并分泌大量ECM，膠原纖維的合成和分解失衡，導(dǎo)致肝組織ECM 過度沉積。目前尚無美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的特效的抗肝纖維化的化學(xué)或生物藥物進入臨床應(yīng)用。槲皮素是一種黃酮類化合物（結(jié)構(gòu)式見圖1），廣泛存在于蔬菜、水果、茶等植物的花、葉、果實中，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制新生血管生成等作用[3]。研究證實槲皮素對多種實驗性肝纖維化模型具有很好的保護作用[4-7]，對其抗肝纖維化作用機制NF-κB/IκBα、Wnt 等信號傳導(dǎo)通路方面進行了有益的探討[4-8]，但仍然不夠全面。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β介導(dǎo)的TGF-β/Smad 通路和非Smad依賴通路（如TGF-β/TAK1/JNK 信號傳導(dǎo)通路）在肝星狀細胞的活化、增殖以及膠原合成的過程中發(fā)揮了非常重要的調(diào)控作用[9-12]。為探討槲皮素抗纖維化的作用機制與TGF-β/TAK1/JNK 和TGF-β/Smad2 信號通路之間的關(guān)聯(lián)，本研究構(gòu)建了二甲基亞硝胺（DMN）誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型和TGF-β誘導(dǎo)HSC-T6 細胞活化模型，從體內(nèi)和體外兩個方面，著重考察槲皮素對TGF-β/TAK1/JNK 和TGF-β/Smad2 信號通路的影響。

圖1 槲皮素的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of quercetin

1 材料

槲皮素（CAS：117-39-5，上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，純度≥98%），DMN（Sigma），TAK1、Phospho-TAK1、JNK、Phospho-SAPK/JNK（美國Cell signaling Technology），Smad2、Phospho-Smad2 單克隆抗體、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）（美國Santa Cruz Biotechnology），轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）（美國R&D Systems），免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），大鼠肝功能檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），血清肝纖維化指標(biāo)檢測試劑盒（鄭州安圖生物工程股份有限公司）。引物序列由上海生工工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；其他主要試劑均購自碧云天生物技術(shù)公司。

全自動生化分析儀（美國Beckman LX-2）；Nanodrop 2000 分光光度計（Thermo Fisher Scientific）；LightCycler 480儀器（Hoffman-La Roche）；奧德賽紅外探測及圖像成像分析系統(tǒng)（LI-COR Biotechnology，Nebraska）。

SPF 級雄性SD 大鼠40 只[6 周齡，180 ～220 g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬） 2013-0016]，飼養(yǎng)條件為標(biāo)準(zhǔn)動物實驗室：溫度25℃，濕度（55±10）%，12 h/12 h 明暗循環(huán)，給予標(biāo)準(zhǔn)的食物和水。

2 方法

2.1 大鼠分組及給藥

SPF 級雄性SD 大鼠40 只適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周后，將大鼠隨機分為正常組，DMN 模型組，槲皮素12.5 mg·kg-1組、25 mg·kg-1組和50 mg·kg-1組，每組8 只。除正常組腹腔注射相同劑量生理鹽水外，其余大鼠均腹腔注射1% DMN（10 mg·kg-1），每周3 次（每周前3日每日一次，連續(xù)注射3 次，后4日不給予注射），共4 周[13]。造模第3 周開始灌胃給予槲皮素治療，每日一次，治療2 周。在第4 周結(jié)束時，再次稱量大鼠體質(zhì)量（空腹），并用5%水合氯醛麻醉，然后，從腹主動脈快速獲取新鮮血液樣本，3000 r·min-1、4℃離心10 min，-80℃下儲存。所有肝臟樣本獲取后迅速稱重，部分用4%多聚甲醛固定，進行組織病理學(xué)和免疫組化檢測。剩余的肝臟樣本液氮速凍后，在-80℃下冷凍保存。

2.2 肝功能、肝纖維化指標(biāo)檢測

采用全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）。采用肝纖維化系列檢測試劑盒測定透明質(zhì)酸（HA）、血清Ⅲ型前膠原氨基末端前肽（PⅢNP）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）和層粘連蛋白（LN）的水平。采用羥脯氨酸檢測試劑盒檢測肝組織中羥脯氨酸的含量。

2.3 肝臟組織病理學(xué)觀察和免疫組化檢測

將4%多聚甲醛固定24 h 的肝組織標(biāo)本，經(jīng)脫水，石蠟包埋后，制成5 μm 厚的切片，再經(jīng)脫蠟沖洗，用蘇木精伊紅（HE）染色、天狼星紅（Sirius）和Masson 三色染色方法進行切片染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟病理情況和膠原沉積的變化，并用Image pro-Plus 6.0 軟件計算肝組織中的膠原形成面積（膠原形成面積＝陽性染色面積/總面積×100%）。用抗α-SMA、p-TAK1、p-JNK、Smad2 的抗體進行免疫組化染色，黃色或棕褐色染色顯示陽性信號，根據(jù)陽性染色的程度和位置進行評估[14]。

2.4 肝組織mRNA 定量PCR 檢測

按QIAGEN 總RNA 提取試劑盒說明書，稱取約30 mg 肝組織，用TRIzol 試劑均質(zhì)離心提取mRNA，Nanodrop 2000 分光光度計測定濃度。按照TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄及PCR 試劑盒說明書，在LightCycler 480 儀器上進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 并擴增。以β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCT公式對目的基因進行定量分析。引物序列及擴增產(chǎn)物長度如表1所示。

表1 mRNA 擴增的基因引物序列Tab 1 Geneprimer sequences for mRNA amplification

2.5 MTT 法檢測槲皮素對HSC-T6 細胞增殖的影響

對數(shù)生長期HSC-T6 細胞消化離心后，用10%血清的DMEM 培養(yǎng)基調(diào)成5×104個·mL-1的混懸液接種于96 孔板中，每孔100 μL，使細胞數(shù)為5000 個/孔，將細胞分為正常組、槲皮素6 個質(zhì)量濃度梯度（2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1），每組3 個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，正常對照組加100 μL 培養(yǎng)基，其余各組加相應(yīng)的藥物100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL MTT 溶液（5 mg·mL-1），4 h 后棄去上清液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm 處測各孔吸光度值（OD），將正常對照組的細胞活性設(shè)為100%，計算槲皮素各濃度處理組細胞活性，細胞活性（%）＝（實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

2.6 定量PCR 檢測HSC-T6 細胞活化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄情況

對數(shù)生長期HSC-T6 細胞消化離心后，用無血清的DMEM 培養(yǎng)基調(diào)成5×104個·mL-1混懸液，接種于6 孔板中，每孔2 mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；將細胞分為正常組、TGF-β1（2 ng·mL-1）組、TGF-β1+槲皮素（10、20、40 μmol·L-1）處理組；在TGF-β1 和槲皮素共同處理24 h 后，提取總RNA，按照TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄及PCR 試劑盒說明書，在LightCycler 480 儀器上進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 并擴增。以β-actin 為內(nèi)參，用2-ΔΔCT公式對目的基因（α-SMA、CollagenⅠ、MMP-I、TIMP-1）進行定量分析。

2.7 Western blot 法檢測 HSC-T6 蛋白表達

取對數(shù)生長期 HSC-T6 細胞，按“2.6”項下方法處理并分組。槲皮素預(yù)處理24 h 后，加入TGF-β1 刺激30 min；提取總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，沸水浴變性15 min，取30 μg 蛋白上樣，待SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用5% BSA 溶液4 ℃封閉3 h，加入一抗（1∶1000），4 ℃過夜；TBST 洗滌3 次，5 min/次，加入二抗（驢抗鼠Alexa Fluor 546 IgG 或驢抗兔Alexa Fluor 488 IgG），室溫孵育2 h。采用奧德賽紅外探測及圖像成像分析系統(tǒng)進行檢測，以GAPDH 為內(nèi)參，計算目的條帶的灰度值[15]。

2.8 統(tǒng)計分析

使用SPSS 21.0 對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，統(tǒng)計分析方法采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 槲皮素對DMN 誘導(dǎo)的大鼠肝臟總體形態(tài)及肝質(zhì)量的影響

DMN 造模期間大鼠體質(zhì)量增長情況如圖2A所示，與正常組相比，DMN 模型組大鼠體質(zhì)量增長顯著下降（P＜0.05），而槲皮素各給藥組的體質(zhì)量增長情況好于DMN 模型組，尤其是25 和50 mg·kg-1治療組（P＜0.05）。造模結(jié)束時各組大鼠體質(zhì)量如圖2B 所示，DMN 模型組大鼠體質(zhì)量顯著低于正常組（P＜0.05）；而同模型組相比，槲皮素25 和50 mg·kg-1治療組能劑量依賴性地提高大鼠體質(zhì)量（P＜0.05）。

圖2B 顯示，DMN 模型組大鼠的肝質(zhì)量同正常組相比亦顯著下降（P＜0.05），而槲皮素25和50 mg·kg-1治療組大鼠的肝質(zhì)量顯著高于模型組（P＜0.05），其中槲皮素50 mg·kg-1組的治療效果最優(yōu)（P＜0.05）。

圖2 大鼠體質(zhì)量和肝質(zhì)量Fig 2 Body mass and liver mass

3.2 肝功能及血清肝纖維化的影響

槲皮素對肝功能指標(biāo)TBIL、ALT 和AST 的影響如圖3A 所示。與正常組相比，DMN 模型組的ALT、AST 和TBIL 水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，槲皮素組TBIL、AST 和ALT 的水平顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，說明槲皮素能顯著改善DMN 誘導(dǎo)的大鼠肝功能。

血清肝纖維化指標(biāo)HA、PⅢNP、Ⅳ-C 和LN的水平如圖3B 所示。DMN 模型組這四項指標(biāo)明顯高于正常組（P＜0.05），說明DMN 造模后，肝組織中膠原合成增加，發(fā)生了顯著的肝損傷和肝纖維化。而槲皮素各給藥組與模型組比較，四項指標(biāo)含量均下降（P＜0.05），50 mg·kg-1下調(diào)效果最顯著（P＜0.05），25 mg·kg-1的治療效果也優(yōu)于12.5 mg·kg-1（P＜0.05）。

圖3 槲皮素對大鼠肝功能（A）及血清肝纖維化（B）的影響Fig 3 Effect of quercetin on the liver function （A） and serum hepatic fibrosis （B）in rats

上述結(jié)果表明，槲皮素可有效減輕DMN誘導(dǎo)的大鼠肝損傷和肝纖維化，在12.5 ～50 mg·kg-1給藥劑量內(nèi)，隨著給藥劑量增加，治療效果逐步提升。

3.3 槲皮素對DMN 誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織病理學(xué)變化的影響

采用HE 染色觀察肝組織病理變化，采用Sirius 和Masson 染色觀察膠原沉積的情況，結(jié)果如圖4A 所示。從圖中可見，正常組肝組織中，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀整齊排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，沒有變性或壞死的肝細胞以及其他病理特征。DMN 模型組肝細胞周圍紊亂，膠原明顯沉積，形成寬窄不一的纖維間隔，包繞、分割肝小葉，小葉結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)擴大，小葉內(nèi)出現(xiàn)壞死，出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤。槲皮素各給藥組能不同程度地改善肝組織損傷，減少膠原生成，降低肝小葉被破壞的程度，尤其在50 mg·kg-1組，肝臟病變和炎性細胞浸潤明顯減少。

如圖4B 所示，與正常組相比，DMN 模型組膠原面積急劇擴大，羥脯氨酸含量顯著升高（P＜0.05），槲皮素25 和50 mg·kg-1治療2周后，能顯著抑制膠原的生成，降低羥脯氨酸的含量，且50 mg·kg-1的槲皮素治療效果優(yōu)于25 mg·kg-1（P＜0.05）。

圖4 槲皮素對DMN 誘導(dǎo)大鼠肝組織的病理學(xué)變化及膠原合成的影響Fig 4 Effect of quercetin on the pathological changes and collagen synthesis of liver tissues in rats induced by DMN

3.4 槲皮素對纖維化肝組織中纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

采用Real-time PCR 檢測肝組織中星狀細胞活化相關(guān)基因（α-SMA、E-cadherin、Snail），膠原合成相關(guān)基因（CollagenⅠ和CollagenⅢ），以及膠原降解相關(guān)基因（TIMP-1和MMP-1）的mRNA水平，結(jié)果如圖5所示。與正常組相比，DMN模型組大鼠肝組織中α-SMA、Snail、CollagenⅠ、CollagenⅢ和TIMP-1的mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）， 而MMP-1和E-cadherin的mRNA水平顯著下調(diào)（P＜0.05）；與DMN 模型組相比，槲皮素給藥組能顯著上調(diào)MMP-1和E-cadherin的mRNA 水平，并顯著抑制α-SMA、Snail、CollagenⅠ、CollagenⅢ和TIMP-1 的mRNA 水平，且效果呈劑量依賴性，50 mg·kg-1效果最顯著（P＜0.05）。

圖5 槲皮素抑制DMN 誘導(dǎo)大鼠肝組織的纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄Fig 5 Quercetin inhibits the transcription of fibrosis related genes in rat liver induced by DMN

3.5 槲皮素對纖維化肝組織中α-SMA、p-TAK1、p-JNK、Smad2 蛋白表達的影響

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果如圖6所示。與正常組相比，DMN 模型組大鼠肝組織中α-SMA、p-TAK1、p-JNK、Smad2 蛋白表達水平明顯升高；槲皮素各給藥組肝組織中這些蛋白表達顯著降低，并且槲皮素25 和50 mg·kg-1組降低較明顯。

圖6 槲皮素對DMN 誘導(dǎo)的纖維化肝組織表達纖維化相關(guān)蛋白的調(diào)控作用Fig 6 Effect of quercetin on the expression of fibrosis related proteins in DMN induced fibrotic liver tissues

3.6 槲皮素對肝星狀細胞HSC-T6 增殖活性的影響

通過MTT 法檢測槲皮素對HSC-T6 細胞增殖活性的影響，結(jié)果如圖7所示。低于10 μmol·L-1的槲皮素處理24 h，對HSC-T6 細胞的增殖基本沒有影響；當(dāng)槲皮素濃度升至20 μmol·L-1時，顯示出一定的抑制作用，細胞活性為84.07%（P＜0.05）；隨著濃度繼續(xù)上升，槲皮素對HSC-T6 細胞的增殖抑制作用越來越強，當(dāng)濃度達到80 μmol·L-1時，細胞活性為70.5%（P＜0.01）。

圖7 槲皮素對HSC-T6 細胞增殖活性的抑制作用Fig 7 Inhibitory effect of quercetin on the proliferation of HSC-T6 cells

3.7 槲皮素對TGF-β1 刺激下HSC-T6 細胞肝纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

通過Real-time PCR 評估槲皮素對HSC 活化標(biāo)志物α-SMA基因，膠原合成與降解相關(guān)基因（CollagenⅠ、MMP-1、TIMP-1）的轉(zhuǎn)錄水平的影響，如圖8所示。與正常組比較，TGF-β1（2 ng·mL-1）刺激24 h，除MMP-1降低外，α-SMA、CollagenⅠ、TIMP-1的mRNA 水平均顯著升高（P＜0.05）；與TGF-β1 刺激組相比，槲皮素（10 ～40 μmol·L-1）處理24 h，能劑量依賴性地抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄變化（P＜0.05）。

圖8 槲皮素對HSC-T6 細胞肝纖維化相關(guān)基因mRNA 水平的影響Fig 8 Effect of quercetin on the mRNA levels of fibrosis-related factors in HSC-T6 cells

3.8 槲皮素對TGF-β/TAK1/JNK 和TGF-β/Smad2信號傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達水平的影響

采用Western blot 法檢測TGF-β/TAK1/JNK 和TGF-β/Smad2 信號傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白在HSC-T6 細胞中的變化情況，結(jié)果如圖9所示。與正常組相比，TGF-β1（2 ng·mL-1）刺激30 min，能顯著地升高p-TAK1、p-JNK 和p-Smad2 水平（P＜0.05）；槲皮素（20、40 μmol·L-1）預(yù)處理24 h 能劑量依賴性地下調(diào)p-TAK1、p-JNK 和p-Smad2水平（P＜0.05）。

圖9 槲皮素對HSC-T6 細胞TGF-β/TAK1/JNK 和TGF-β/Smad2 信號通路的調(diào)控作用Fig 9 Regulation of quercetin on TGF-β/TAK1/JNK and TGF-β/Smad2 signal pathways in HSC-T6 cells

4 討論

肝纖維化是各種慢性肝損傷因素誘發(fā)的肝組織損傷修復(fù)反應(yīng)，是各種慢性肝病向肝硬化進展的共同病理過程，由于肝纖維化具有可逆性特點，因此防治肝纖維化對于防治肝硬化具有重要的臨床意義[16]。

DMN 誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，是常用的實驗性肝纖維化動物模型[13，15]。本研究中發(fā)現(xiàn)槲皮素治療2 周，能劑量依賴性地下調(diào)DMN 誘導(dǎo)肝纖維化大鼠血清ALT、AST 和TBIL 水平，改善大鼠肝功能；同時有效抑制血清肝纖維化指標(biāo)上升，降低肝組織中羥脯氨酸的含量；對肝組織切片進行HE、Sirius 和Masson 染色，結(jié)果同樣表明槲皮素可以有效抑制膠原生成，保護肝小葉的正常結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果說明槲皮素能有效緩解DMN誘導(dǎo)的大鼠肝損傷，降低膠原的沉積，阻遏肝纖維化的進程。

肝星狀細胞的活化并大量合成膠原蛋白是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[17]。活化的星狀細胞其特征性表現(xiàn)為：高表達α-SMA、Snail和TIMP-1[18-20]，低表達E-cadherin和MMP-1[21-22]，并且大量合成Ⅰ、Ⅲ型膠原等[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素能劑量依賴性地下調(diào)肝星狀細胞中α-SMA、Snail、TIMP-1以及CollagenⅠ、CollagenⅢ的mRNA 水平，同時上調(diào)E-cadherin和MMP-1的mRNA 水平。這表明槲皮素能有效抑制肝星狀細胞的活化及合成膠原蛋白。

肝星狀細胞的活化機制與TGF-β介導(dǎo)的信號通路密切相關(guān)[24]。TGF-β首先在細胞表面與TGF-βⅡ型受體（TβRⅡ）結(jié)合后，募集并激活TGF-βⅠ型受體（TβRⅠ）；活化的TβRⅠ進而招募并磷酸化激活受體Smad2 和Smad3；然后激活的p-Smad2/3 與胞漿中的共同通路型 Smad4形成異源復(fù)合體，轉(zhuǎn)入胞核，調(diào)控肝星狀細胞活化相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，此為典型的TGF-β信號通路[25-26]。同樣活化的TβRⅠ也可以激活非Smad 依賴的TAK1/JNK 信號傳導(dǎo)通路。TAKl 屬于MAPKKK 家族成員，活化后可以通過激活MAPKK4/7 而磷酸化JNK（p-JNK）[27]；JNK 是MAPK 家族的成員，活化的JNK（p-JNK）進一步激活其底物（包括c-Jun、ATF2、Elk1、p53、NFAT4 等），從而調(diào)控肝星狀細胞的活化和增殖，參與肝纖維化形成[28]。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能顯著下調(diào)DMN 誘導(dǎo)肝纖維化模型大鼠肝組織中p-TAK1、p-JNK 以及Smad2 的水平；能劑量依賴性地下調(diào)p-TAK1、p-JNK 和p-Smad2 水平。這些結(jié)果充分說明，槲皮素能通過抑制TGF-β/Smad和TGF-β/TAK1/JNK 信號通路活化，從而抑制星狀細胞活化。

綜上，本研究證實槲皮素具有顯著的抗DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化作用，通過抑制TGF-β/Smad和TGF-β/TAK1/JNK 信號通路的激活與傳導(dǎo)，來抑制肝星狀細胞的活化和增殖，最終逆轉(zhuǎn)肝纖維化進程。