矮地茶對刀豆蛋白A致大鼠免疫性肝損傷的保護作用及機制探討

韓冰，程棟梁，林世源，陳卉，張瑋，奉建芳，吳衛*（. 桂林醫學院藥學院，廣西 桂林 5499；. 廣西中醫藥大學藥學院，南寧 53000）

據世界衛生組織統計，全球肝臟疾病已達到13 億，影響人類健康發展并構成全球主要的公共衛生問題之一[1]。病毒性肝炎、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷以及遺傳性肝臟疾病是導致急性肝衰竭及死亡的主要病因。肝臟炎癥和肝損傷是免疫細胞和細胞趨化、生長、凋亡因子相互作用的結果，在肝臟疾病的發展過程中起重要作用[2]。由于肝組織血供豐富、流速慢，免疫細胞易停留、作用于肝臟，釋放促炎細胞因子及活性氧簇等分子，這些細胞因子和免疫應答之間的相互作用決定了肝臟病理的發展[3-4]，如不加以干預治療，會逐漸演變成肝癌，導致死亡。目前肝臟疾病治療方式以對癥治療為主，肝移植逐漸在臨床上應用，但肝源稀少、治療費用高、技術設備要求高等限制了其應用[5-6]，目前尚無特效治療藥物及手段。

矮地茶為紫金牛科植物紫金牛[Ardisia japonica（Thunb）Blume]的干燥全株，又名平地木、不出林等，廣泛分布于長江流域以南各地[7]。《中國藥典》2015年版一部記載矮地茶具有化痰止咳、清利濕熱、活血化瘀的功效，用于新久咳嗽、濕熱黃疸、經閉瘀阻、跌打損傷、風濕痹痛。矮地茶主要含有皂苷類、香豆素類、苯醌類和黃酮類等成分，具有止咳平喘、保肝抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理活性[8-12]。《本草綱目》記載其有治療肝炎、急性腎炎、膀胱炎等功效。在廣西、湖南等地區，民間常用矮地茶來治療慢性肝炎，取得了良好的治療效果。但其抗炎保肝作用機制及其藥效物質基礎尚不明確。

外界異物（病毒、藥物、酒精、化學品）進入體內，引發機體自身免疫應答機制，分化大量炎癥細胞，浸潤肝臟組織是導致肝損傷的主要原因。刀豆球蛋白 A（Con-A）誘導的肝損傷與病毒性肝炎、自身性免疫性肝病和肝衰竭病理生理過程中的肝臟免疫反應極其相似，造模方法已成熟且應用較為廣泛[13]。本文以Con-A 誘導的急性肝損傷SD 大鼠為病理模型，探究中藥矮地茶對肝損傷的保護作用及機制，為矮地茶進一步開發及應用提供資料。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠78 只，4 ～5 周齡，體質量190 ～230 g [湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2019-0004]，飼養環境室溫（23±2）℃，濕度50%～60%。所有大鼠均自由進食飲水，適應性飼養一周。實驗用所有動物均經桂林醫學院實驗動物倫理委員會審查批準（批準號：GLMC201703029）。

1.2 試藥

矮地茶經桂林醫學院吳衛教授鑒定為紫金牛科植物紫金牛的干燥全株；Con-A 試劑盒（批號：SLBT3093，美國Sigma 公司）；血清丙氨酸轉氨酶（ALT）試劑盒（批號：20201015）、天冬氨酸轉氨酶（AST）試劑盒（批號：20201015）、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（批號：20201015）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號：20200724）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號：20200723）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（批號：20200723）、CD4+試劑盒（批號：E-EL-R2459c）、CD8+試劑盒（批號：E-EL-R0219c）（南京建成生物工程研究所）。

1.3 儀器

KD-TS3A 全自動封閉式組織脫水機、KDBM Ⅱ生物組織冷凍包埋機KD-BL 冷凍臺（浙江科迪儀器設備有限公司）；生物組織攤片烤片機（湖北伯納醫療科技有限公司）；BX-51 正置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；iMark 酶標儀（美國Bio-Rad 公司）；RE52CS-1 旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；LC-10N-50A 冷凍干燥機（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；GL-88B 渦旋混合器（其林貝爾儀器制造有限公司）；ES-A電子天平（天津德安特有限公司）；UV-1800 PC紫外分光光度計（上海美普達儀器有限公司）。

2 方法

2.1 干膏制備

將中藥矮地茶全草研磨成粗粉，干燥通風保存。精密稱定干燥矮地茶粗粉400 g 4 份，置于2000 mL 圓底燒瓶內，做好標記。分別分批加入10 倍量體積的60%、70%、80%、90%乙醇，加熱回流提取兩次，首次2.5 h，末次1.5 h。各提取液分別減壓濃縮，回收乙醇，冷凍干燥得矮地茶60%、70%、80%、90%乙醇提取物干膏40.08 g、40.26 g、39.86 g、40.38 g。每克干膏相當于生藥量9.98 g、9.94 g、10.03 g、9.91 g。陰涼干燥處保存，待后續實驗使用（給藥濃度均以浸膏重量計）。

2.2 造模及給藥

2.2.1 矮地茶不同溶劑提取物的藥效學考察 將36 只SD 大鼠隨機分為6 組，空白組、模型組及矮地茶干預組（60%、70%、80%、90%乙醇提取物），每組6 只。空白組和模型組灌服等體積生理鹽水，矮地茶干預組分別灌服60%、70%、80%、90%乙醇提取物干膏（20 mg·kg-1），1次·d-1，連續給藥7 d；末次給藥2 h 后，除空白組外，各組大鼠均一次性尾靜脈注射劑量為20 mg·kg-1的Con-A 進行造模。造模結束后的各組大鼠，均禁食不禁水12 h，稱定大鼠體質量后取樣。

2.2.2 矮地茶不同給藥劑量的藥效學考察 在確定矮地茶提取溶劑（80%乙醇）的基礎上，進行給藥劑量的考察。將30 只SD 大鼠隨機分為5 組，空白組、模型組及矮地茶低、中、高劑量組（10、20、30 mg·kg-13 種給藥劑量），每組6 只。空白組和模型組灌服等體積生理鹽水，矮地茶干預組分別灌服對應劑量矮地茶，1 次·d-1，連續給藥7 d；末次給藥2 h 后，除空白組外，各組大鼠均一次性尾靜脈注射20 mg·kg-1Con-A 造模。造模結束的各組大鼠，均禁食不禁水12 h，稱定大鼠體質量后，異氟烷麻醉，開始取樣。

2.3 血清ALT、AST、ALP 水平的測定

造模12 h 后，將各組SD 大鼠用異氟烷麻醉，酒精消毒，腹主動脈取血，使用肝素抗凝，3500 r·min-1離心10 min 后取上清液，-20℃冰箱保存待用。于一周內按試劑盒操作檢測血清ALT、AST、ALP 水平。

2.4 肝臟指數、脾臟指數的測定

造模12 h 后，將各組大鼠用異氟烷麻醉，酒精消毒，腹主動脈取血后，取肝臟、脾臟稱定質量，頸椎脫臼處死大鼠，計算肝臟指數、脾臟指數[肝臟或脾臟質量/體質量×100%]。

2.5 肝臟組織中 MDA、SOD、HYP、GSH-Px 水平的測定

剪取肝右小葉同一部位組織，于冰浴中用生理鹽水制成10%肝組織勻漿并離心，取上清液，置-20℃冰箱保存待用。于一周內按試劑盒操作檢測MDA、SOD、GSH-Px 水平。

2.6 HE 染色觀察肝臟組織病理

取肝左葉同一部位組織，修剪為1 cm3大小組織塊，中性甲醛固定，脫水、包埋、常規制備切片，HE 染色，光鏡下觀察病理切片并拍照。

2.7 ELISA 檢測淋巴細胞中的CD4+、CD8+

剪取肝右小葉同一部位組織，于冰浴中用生理鹽水制成10%肝組織勻漿并離心，取上清液，置于-20℃冰箱保存待用。根據試劑盒操作要求稀釋成相應濃度肝組織勻漿進行CD4+、CD8+陽性細胞數量的測定。

2.8 統計學分析

應用GraphPad Prism 8 軟件進行分析，血清與肝臟組織檢測指標以（±s）表示，符合正態分布且方差齊性資料采用獨立樣本t檢驗；以P≤0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 矮地茶不同溶劑提取物的藥效學考察

3.1.1 不同溶劑提取物對肝損傷大鼠肝脾指數的影響 模型組較空白組肝臟、脾臟指數均顯著升高（P＜0.01，P＜0.001）；與模型組相比，60%、90%乙醇提取物肝臟指數均無明顯差異。70%、80%乙醇組肝臟指數顯著降低（P＜0.05）。矮地茶各個濃度乙醇提物組脾臟指數較模型組均無明顯差異（見表1）。

表1 矮地茶不同溶劑提取物對大鼠肝臟、脾臟指數的影響Tab 1 Effect of different extraction of Ardisiae japonicae herba on liver and spleen index in rats

3.1.2 不同溶劑提取物對肝損傷大鼠血清AST、ALT 的影響 與空白組相比，模型組大鼠血清AST、ALT 水平顯著升高（P＜0.0001）；與模型組相比，矮地茶70%、90%乙醇提取物對AST、ALT 水平無降低作用；60%乙醇提取物物能夠顯著降低AST 水平但對ALT 水平無影響；80%乙醇提取物組AST、ALT 水平均顯著降低（P＜0.01，P＜0.001），見圖1。

圖1 矮地茶不同溶劑提取物對大鼠血清AST、ALT 的影響Fig 1 Effect of different extraction of Ardisiae japonicae herba on the serum AST and ALT in rats

3.1.3 不同溶劑提取物對肝損傷大鼠肝組織病理變化的影響 HE 染色結果顯示，模型組肝細胞索斷裂且排列混亂，細胞腫脹，細胞膜邊緣模糊，有炎性細胞浸潤。80%乙醇提取物組肝索排列較模型組整齊，且細胞無明顯腫脹（見圖2）。

圖2 矮地茶不同溶劑提取物對大鼠肝組織病理變化的影響Fig 2 Effect of different extraction of Ardisiae japonicae herba on hepatic tissue pathological features in rats

3.2 矮地茶80%乙醇提取物不同給藥劑量的藥效學考察

3.2.1 不同給藥劑量對肝損傷大鼠肝脾指數的影響 與空白組相比，模型組肝臟、脾臟指數顯著增大（P＜0.001）。與模型組相比，矮地茶低、中劑量組能降低大鼠肝臟指數（P＜0.05），高劑量組肝臟指數雖有降低但差異無統計學意義。矮地茶低、中、高劑量組脾臟指數與模型組相比均無顯著差異（見表2）。

表2 不同給藥劑量對大鼠肝脾指數的影響Tab 2 Effect of different doses on liver and spleen index in rats

3.2.2 不同給藥劑量對肝損傷大鼠血清AST、ALT、ALP 的影響 如圖3所示，與空白組相比，模型組血清AST、ALT、ALP 活性顯著升高（P＜0.001）；與模型組相比，矮地茶低、中、高劑量組均能降低AST、ALT 活性（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；矮地茶低、中劑量組均能降低ALP 活性（P＜0.01）。

圖3 矮地茶不同給藥劑量對大鼠血清AST、ALT、ALP 的影響Fig 3 Effect of different doses of Ardisiae japonicae herba on the serum AST，ALT and ALP in rats

3.2.3 不同給藥劑量對肝損傷大鼠MDA、SOD、GSH-Px 的影響 如圖4所示，與空白組相比，模型組肝組織GSH-Px、SOD 水平顯著降低（P＜0.001），MDA 水平顯著升高（P＜0.0001）；與模型組相比，矮地茶低、中劑量組均能顯著降低MDA 水平（P＜0.05），高劑量組無改善；矮地茶低、中、高劑量組能顯著升高SOD（P＜0.001）及GSH-Px 活力水平（P＜0.01，P＜0.001），中劑量組最為明顯。

圖4 矮地茶不同給藥劑量對MDA、SOD、GSH-Px 的影響Fig 4 Effect of different doses of Ardisiae japonicae herba on MDA，SOD and GSH-Px

3.2.4 不同給藥劑量對肝損傷大鼠肝組織CD4+、CD8+數量的影響 如圖5所示，與空白組相比，模型組T 淋巴細胞CD4+、CD8+細胞數量均顯著上升（P＜0.05，P＜0.001）。與模型組相比，矮地茶各干預組CD4+、CD8+細胞數量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 矮地茶不同給藥劑量對CD4+、CD8+的影響Fig 5 Effect of different doses of Ardisiae japonicae herba on CD4+and CD8+

3.2.5 不同給藥劑量對肝損傷大鼠肝組織病理變化的影響 如圖6所示，模型組肝索排列紊亂，有肝索斷裂跡象。細胞膜邊緣模糊，且細胞腫脹明顯，伴有大量炎性浸潤。矮地茶各干預組肝索排列較為整齊，炎性浸潤肉眼可見有所減輕，中劑量組的保護作用較其他組顯著。

圖6 矮地茶不同給藥劑量對大鼠肝組織病理變化的影響Fig 6 Effect of different doses of Ardisiae japonicae herba on hepatic tissue pathological features in rats

4 討論

中藥矮地茶為南方地區民間草藥，常用于治療肝炎，但缺乏相應的理論研究。本文通過Con-A 誘導免疫性肝損傷大鼠動物模型，探討矮地茶抗炎保肝的藥效及作用機制，為民間用藥的合理性提供理論依據。

本文主要以血清AST、ALT、ALP 水平和HE 病理切片以及肝組織MDA、SOD、GSH-Px、T 淋巴細胞亞群指標來初步探究矮地茶抗Con-A誘導肝損傷藥效及保護作用機制。血清AST、ALT、ALP 可以反映肝細胞受損程度以及線粒體損傷的情況[14]，AST 與ALT 存在于肝細胞質與線粒體，并作用于肝臟，當肝細胞受損，這兩種酶便釋放到血液中。本研究發現，矮地茶降低血清中AST、ALT、ALP 水平效果明顯，證明對Con-A 誘導的肝損傷有一定的保護作用。

此前，已有研究證明肝損傷過程中氧化應激指標異常，MDA 為機體脂質過氧化物的最終產物，可嚴重破壞細胞膜結構，間接反映肝細胞損傷程度。SOD 是源于機體的活性物質，能消除機體在新陳代謝過程中產生的具有氧化性質的一類物質即活性氧（ROS），降低由ROS 引起的機體過氧化產生的肝損傷[15]。本研究發現大鼠經Con-A 誘導建模后，模型組肝組織中MDA 水平顯著升高，SOD 活力水平顯著降低，提示Con-A可能誘導肝組織細胞一系列氧化應激反應，抑制SOD 的活力，從而降低機體清除ROS 的能力，加重肝細胞損傷。GSH 是細胞抗氧化主要成分，在肝臟內合成最多，GSH-Px 酶以GSH 為底物，限制脂質過氧化，從而預防細胞膜受損，減少機體氧化反應產生的自由基對DNA 的損害，從而對肝臟起到保護作用。結果表明，Con-A 誘導SD 大鼠造模后，GSH-Px 活力顯著降低，矮地茶干預后，能夠有效降低MDA 水平，升高SOD 活力水平，上調GSH-Px 活力水平，推測矮地茶可能通過調控氧化應激反應來應對Con-A 誘導的肝損傷作用。

研究表明，Con-A 誘導肝損傷動物模型主要是通過活化T 淋巴細胞致免疫性肝損傷，Con-A刺激T 淋巴細胞，激活肝臟組織免疫反應，CD4+、CD8+兩種T 淋巴細胞集聚肝門區，釋放炎癥因子攻擊肝組織，致使肝細胞壞死、凋亡，肝組織受損[3，13]。CD4+為輔助T 細胞（Th 細胞）的總稱，Th 細胞受刺激后會分化成Th0、Th1、Th2 等，這些被活化得的淋巴細胞會分泌IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ等炎癥因子，炎癥因子浸潤肝細胞導致損傷產生。本研究發現CD4+、CD8+兩種T 淋巴細胞在模型組較空白組表達顯著升高，矮地茶干預組能夠降低CD4+、CD8+T 淋巴細胞表達，抑制T 淋巴細胞分化，調節T 淋巴細胞亞群，改善免疫功能紊亂，降低炎癥因子對于肝臟組織的浸潤，起到保護肝臟組織的作用。

綜上，矮地茶80%乙醇提取物中20 mg·kg-1劑量組在降低AST、ALT、ALP、MDA、CD4+、CD8+水平，在升高GSH-Px、SOD 水平最為顯著。本文通過Con-A 誘導免疫性肝損傷大鼠動物模型，探討矮地茶抗炎保肝的藥效及作用機制，為民間用藥的合理性提供理論依據。