超聲輔助酶法提取藍靛果中綠原酸工藝研究

劉艷杰，邢振楠，王丹麗，馬珂，劉邦

(黑龍江省林業科學院伊春分院，黑龍江 伊春 153000)

藍靛果(LoniceraedulisTurcz.)落葉小灌木,忍冬科忍冬屬[2]。常生長于寒帶地區,植被越冬不需要抗寒,其果實中營養豐富,擁有多種人們日常所需的維生素、礦物質，另外它的花青素含量較高、普遍高于藍莓中的花青素含量，因此常用來開發營養價值較高的保健品，在森林食品等方面廣泛應用[3]。研究結果表明，藍靛果的果實富含多種酚類物質，其中非花色苷酚類主要有綠原酸、新綠原酸、槲皮索-3-蕓香糖苷和槲皮素-3-葡萄糖苷等。綠原酸是一種重要的生物活性物質，它又許多功效，其中抗腫瘤、降血壓、血脂、清除自由基等功效最為顯著[4]。因此,從藍靛果中提取綠原酸具有很高的應用價值和經濟價值，可以顯著提高藍靛果的經濟附加值，實現藍靛果的綜合利用。超聲波輔助提取法具有明顯優勢，可以明顯提高提取效率，并且易實現大規模的工業化應用。同時，用酶法提取可以加快細胞壁結構破壞的速度和程度，顯著改善提取效果[5]。然而，采用超聲波輔助酶法提取藍靛果中綠原酸活性成分的研究未見報道。以藍靛果為原料，利用超聲波輔助酶法提取綠原酸，并用正交實驗對其提取條件進行了優化。為藍靛果中綠原酸有效成分的提取探索一種新的途徑。

1 儀器與材料

藍靛果(產于小興安嶺伊春)，綠原酸標準品、甲醇、中性蛋白酶，纖維素酶，果膠酶，淀粉酶均購自上海源葉生物科技有限公司，其他試劑均為分析純。

真空泵、旋轉蒸發儀、電子天平、分液漏斗、酸度計、移液器、電子天平、紫外可見分光光度計、超聲波發生器、 恒溫水浴禍、離心機等。

2 方法與結果

2.1 實驗方法

2.1.1 藍靛果中綠原酸酶法提取的單因素實驗。將藍靛果完全破碎以破碎作為實驗原料，按照1∶10的比例加入水(料液比，w/w)，加入酶，用恒溫酶解。經過酶解處理完成的藍靛果用超聲波作用30 min。分別實驗提取溫度、酶的種類、酶解的時間、酶的用量等對藍靛果中綠原酸提取率的影響。

2.1.2 超聲輔助酶法提取的顯著性作用實驗。在其他實驗條件相同的情況下，比較酶法處理藍靛果和超聲輔助酶法處理藍靛果對藍靛果中綠原酸提取率的影響。

2.1.3 超聲輔助酶法提取藍靛果中綠原酸條件的優化。以單因素實驗結果為基礎，設置不同的酶解反應用量、酶解反應溫度、酶解反應時間為實驗指標因素，通過L9(34)正交實驗，研究超聲輔助酶法提取藍靛果中綠原酸提取率的工藝，以優化出藍靛果中綠原酸用酶法提取的最佳工藝參數。

2.1.4 分析方法[6]。參照朱松等的檢測方法，采用高效液相色譜法定量分析提取出的綠原酸。

2.2 結果分析

2.2.1 酶種類對提取效果的影響。取藍靛果處理后樣品5 g，按照1∶10的料水比例，加入50 mL水，分別添加酶制劑，水浴鍋中酶解溫度設定為40 ℃，反應時間定時60 min，當水浴鍋溫度升高至85 ℃時滅酶，冷卻至室溫，用HPLC法測定產物中綠原酸含量，并根據公式計算提取率，結果見圖1。由圖一可以看出，用1%的纖維素酶處理后，得到的藍靛果中綠原酸提取率最大，故藍靛果中綠原酸提取的最佳酶制劑為纖維素酶[7]。

圖1 酶種類對藍靛果中綠原酸提取的影響

2.2.2 酶的用量對提取效果的影響。從圖2可以看出，隨著酶用量的增加，綠原酸的提取率是不斷升高的，但當酶的用量達到1.5% 時，盡管酶的添加量再增加，對綠原酸的提取效果的影響卻沒有明顯變化。分析原因可能當酶添加量未達到最佳量時，酶解反應進行得不十分完全，釋放出的綠原酸量較少，當酶的添加量達到最適宜量時，酶解反應已經進行的較徹底，如果酶的用量再繼續加大，反應進程不會有顯著變化。

圖2 酶用量對提取物的影響

圖3 酶解時間對提取物的影響

由圖3可以看出，隨著酶解反應時間的增加，藍靛果中綠原酸的提取率不斷升高。當底物的酶解時間為1 h時，綠原酸提取率達到峰值。過了峰值后期反應趨于平緩，綠原酸的提取率相對穩定且緩慢下降。這可能是由于當酶的活力得到充分發揮后，酶解反應已進行的較完全，即使反應時間繼續延長，綠原酸的提取率也不會增高。

2.2.3 酶解溫度對提取效果的影響。圖4表明，剛開始加入酶后，綠原酸的提取率是和酶解溫度成正比的，酶解溫度到達40 ℃時，提取率達到峰值。后期綠原酸的提取率隨著反應溫度的升高反而下降。其中可能因為一是酶的活性因溫度的過高而降低，抑制酶解反應，因此綠原酸含量不再增加，甚至有降低的趨勢[8]。二是綠原酸的鄰苯二酚結構不穩定，酶解溫度越高，易氧化分解。所以，最適宜的酶解溫度為40 ℃[3]。

圖4 酶解溫度對綠原酸提取率的影響

2.2.4 超聲作用對酶法提取率的顯著性影響。超聲波輔助法對藍靛果中綠原酸有效成分提取的影響見表1。由表1可以看出，藍靛果中綠原酸有效成分的提取應用超聲波輔助法有顯著影響，藍靛果經超聲波輔助作用后，其中綠原酸的平均提取率從85.2%提高到89.6%，分析原因，可能是由于藍靛果的細胞結構被超聲波作用后，進一步破壞，從而有效的提升了綠原酸的提取率。

表1 超聲波處理對綠原酸提取的影響

2.3 正交實驗優化提取工藝

在單因素實驗數據的基礎上，設計L9(34)正交實驗(見表2、表3)。

表2 因素水平表

表3 正交實驗方案及結果

表4 正交實驗極差分析

由表4可以看出，各單因素對綠原酸提取率的影響大小的順序為A>B>C，由此可確定最佳的提取方案為A3B3C2，即酶解法提取藍靛果中綠原酸的最佳工藝及條件為：酶液量1%，40 ℃水浴中恒溫處理1.5 h；綜合以上實驗結果，提取藍靛果中綠原酸的條件為1%的酶用量、1.5 h的酶解時間，50 ℃的酶解溫度。

3 結論

通過實驗結果可知，在植物有效活性成分的提取實驗中，可將纖維素酶和超聲波兩種辦法結合起來。因為纖維素酶不但能促進植物體內有效成分的釋放，而且是可將植物組織快速和徹底分解的一種有效酶制劑，其反應條件簡單且不破壞生物體的活性。超聲波輔助提取方法因其具有用時短、操作簡單等優點，被廣泛應用于森林食品天然產物有效成分的提取中。因此可將兩種方法結合應用到植物活性成分的提取實驗中。

實驗得出了藍靛果中綠原酸提取的最佳工藝條件為：1%酶的用量 、1.5 h酶解時間、40 ℃酶解溫度。優化了超聲輔助酶法提取藍靛果中綠原酸的工藝，在最佳條件下，藍靛果中綠原酸的提取率為89.6%。因此，可以得出結論，超聲波輔助酶法提取藍靛果中綠原酸，可顯著提高提取率。