達沙替尼納米結構脂質載體的制備與體外評價

侯甲福，劉世娟，耿艷萌，楊琦，胡澤香，謝舒，張穎*

(1.牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院，黑龍江 牡丹江 157011)

0 引言

雖然近十年來已經發現了大量具有多種治療潛力的新藥分子，但其中大多數仍處于研發過程中。主要是因為這類化合物的水溶性較差，從而限制了藥物的生物利用度。達沙替尼(DST) 就屬于這類化合物。在不影響治療效果的情況下，開發DST 的制劑必須克服這些問題。DST 在水中溶解很差，在水中最大溶解度約為10 μg/mL[1]，過低的水溶性導致生物利用度差并且不穩定[2]，DST 的口服生物利用度僅為14%～34%[3]。藥物溶解性差，使得對潛在藥物效應的產品進行高通量篩選非常困難。因此，迫切需要改善DST 的溶解性，從而提高生物利用度。克服難溶性藥物的溶解度問題有很多種方法，包括增溶、形成包合物或絡合等方法，其中目前最先進的技術是納米制劑技術。

由于納米藥物制劑有獨特的優勢，納米制劑技術在世界各地蓬勃發展，各大藥品生產公司生產的納米制劑產品在不斷增長，開發了大量生物相容性納米系統，如納米顆粒、納米膠囊、膠束系統和偶聯物。根據Noyes-Whitney 方程，納米化的優點是通過增加難溶性化合物的表面積和濃度差，然后增加了化合物的溶解速率。此外，納米化后飽和溶解度也增加了[4]。這些增強藥物通過腸壁進入體循環，有利于水溶性差的藥物的口服生物利用度。

納米結構脂質載體(NLC)作為傳統聚合物納米顆粒的替代藥物傳遞系統，納米顆粒在亞微米尺寸范圍內(50～1 000 nm)，由可生理相容的脂質成分組成，室溫情況下顆粒處于固態，結合了聚合物納米顆粒、脂肪乳劑和脂質體的優點。

本研究采用NLC 解決難溶性藥物的吸收，并提高生物利用度。而且NLC 可以通過高壓均質化技術進行大規模的工業生產。NLC 像乳劑和脂質體一樣具有高度的生物相容性，同時固體基質產生緩釋，可以在非腸道給藥后有效地靶向特定組織，并可以改善難溶性藥物[5-6]口服生物利用度。通過將DST 制備成NLC 來增強溶解度，DST 加載NLC 作為靶向遞送系統，可以產生更高的腫瘤細胞特異性，同時降低藥物的毒副作用[5]。

1 儀器與試藥

安捷倫LC1260 高效液相色譜儀；JY92-Ⅱ型細胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；達沙替尼(上海MACKLIN 公司)；單硬脂酸甘油酯(GMS，德國BASF 公司)；辛癸酸甘油酯(MCT，法國Gattefosse公司)；吐溫80(Tween-80，國藥集團化學試劑有限公司)；聚氧乙烯(35)蓖麻油(EL-35，德國BASF 公司)。

2 方法

2.1 DST-NLC 的制備

采用熱熔—超聲乳化法制備DST-NLC，具體操作如下：取處方量的單硬脂酸甘油酯、辛癸酸甘油酯、吐溫80 置于水浴上加熱75 ℃至脂質熔融，將DST 加入熔融脂質液中，攪拌溶解形成有機相，75 ℃水浴下，取處方量的聚氧乙烯蓖麻油加入蒸餾水中形成水相。然后，在磁性攪拌下，將水相滴加入油相中形成初乳。5 min 后，將溶液混合物超聲15 min，然后在冰浴中快速冷卻。隨后，樣品以15 000 r/min 離心5 min，然后用0.22 μm 微孔濾膜過濾，以去除未封裝的藥物。

2.2 含量測定方法

色譜條件：色譜柱Aglient HC-C18(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；柱溫：35 ℃；檢測波長：322 nm；流動相：乙腈-磷酸二氫鉀水溶液(0.01 mol/L，NaOH 溶液調至pH=5.0)(40∶60，V/V)；流速：1.0 mL/min；進樣量20 μL。

方法學考察：

按規定方法操作，得線性方程y=1 578x-1 263 (r=0.999 9)，在該色譜條件下本品在0.01～0.20 mg/mL 濃度范圍內線性關系良好；穩定性：0 h、2 h、4 h 內穩定性良好，RSD=0.56%；精密度實驗RSD=0.18% (n=6)；重復性實驗RSD=0.21%(n=6)；加樣回收率實驗，高中低濃度平均回收率分別為99.67%、101.37%、99.48%，方法學考察均符合要求。

載藥量與包封率測定：

精密吸取DST-NLC 樣品混懸液2 mL 置于超速離心管中，12 000 r/min 高速離心40 min，取濾液，進HPLC 測定游離達沙替尼的量(C)。另取DST-NLC 混懸液2 mL，轉移至50 mL 的容量瓶中，再加入30 mL乙腈超聲8 min，用流動相定容至刻度，高效液相色譜法測定藥物總含量(C0)。按下式計算DST-NLC 的載藥量與包封率。

式(1)～(2) 中：C 為溶液中游離達沙替尼的量；C0為溶液中總達沙替尼的量；C總為脂質載體和總達沙替尼的量。

2.3 處方優化

在單因素考察的基礎之上并結合預實驗，以包封率為評價指標，以對DST-NLC 包封率影響較大的因素，固/ 液脂質比(A，單硬脂酸甘油酯/ 新癸酸甘油酯)、乳化劑用量(B)、藥/ 脂比(C)、超聲時間(D) 為考察因素，進行4 因素3 水平L9(34) 正交試驗，篩選最佳處方，因素水平表如表1 所示。

表1 DST-NLC 處方優化因素水平表

2.4 DST-NLC 體外釋放度試驗

采用膜透析法測定DST 混懸液、DST-NLC 的體外釋放特性。分別精密量取DST 混懸液、DST-NLC 混懸液3 mL，移至透析袋(截留相對分子質量12 000～14 000)中，兩端扎緊，將此透析袋置于37 ℃透析介質(磷酸鹽緩沖溶液，pH=7.4)中，100 r/min。定時取樣5 mL，同時補加相同量的等溫釋放介質，樣品用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液1 mL 加入適量流動相稀釋，采用高效液相色譜法測定DST 濃度，計算DST 累計釋放度(%)。

3 結果

3.1 處方優化

以DST-NLC 包封率為考察指標，處方優化正交實驗設計及結果如表2 所示。

由表2 可知，根據R 數值的大小可知，該試驗中各因素對包封率的影響順序為A＞B＞D＞C，各因素在不同水平的分析結果為A：2＞3＞1；B：3＞2＞1；C：3＞1＞2；D：2＞3＞1。根據K1、K2、K3結果中數值大小，可知最佳組合為A2B3C3D2，即最優處方是，單硬脂酸甘油酯與新癸酸甘油酯比為8∶2，乳化劑用量為6%，藥/脂比為1∶30，超聲時間為4 min。

3.2 體外釋放度試驗

DST-NLC 的體外釋放曲線如圖1 所示。由圖可知，DST-NLC 在0～4 h 釋放藥物較快，能在短時間內使藥物濃度升高，0～12 h 的累積釋放量以達到75% 左右，對比DST 原料藥，DST-NLC 溶出藥量顯著提高。而且，DST-NLC 前期釋放較快，后期釋放緩慢，具有顯著的緩釋特性，無論從釋放速度還是緩釋效果，DST-NLC 均優于DST。

表2 DST-NLC 正交實驗結果

圖1 DST 與DST-NLC 體外釋放藥物曲線

4 結語

藥物的療效有時因為各種傳遞不暢從而無法發揮良好藥效，如藥物溶解性差、藥物清除速度快和各種生物屏障，可以應用各種現代制劑技術來提高藥物的溶解度。然而，應謹慎避免達沙替尼的濃度依賴性毒性，通常具有緩釋特性的藥物傳遞系統可以減輕毒性。在這項研究中，達沙替尼被封裝在NLC 中，NLC是一種以增強溶解度、緩釋和良好的眼部生物相容性而聞名的藥物傳遞系統。本項目采用熔融乳化超聲法制備DST-NLC，在實驗前期摸索中制備的NLC 相當不穩定的，并在第二天沉淀。該NLC 的不穩定性是由于zeta 電位的絕對值較小造成的，由于zeta 勢意味著粒子間的斥力強度，因此zeta 勢的絕對值越高，表明納米顆粒具有更好的抗聚集性和穩定性。一般控制在約30 mV 的絕對值時是最為穩定的，足以保證NLC 的穩定性。吐溫80 是一種良好的表面活性劑，在處方中添加吐溫80 以增加絕對含量提高了NLC的穩定性，同時吐溫80 可以極大地提高NLC 的穩定性和粒徑。當加入20 mg 吐溫80 后，NLC 前兩天未見沉降，第三天只有少量沉降，說明NLC 的穩定性有所提高，但是吐溫80 的含量仍然有些不足。因此在處方中繼續增加吐溫80，產品連續7 天無沉淀，第7 天的平均粒徑與第1 天無顯著差異[6]。

近年來，NLC 納米結構脂質載體的潛力逐漸實現，成為一種很有前景的藥物傳遞系統。許多具有治療活性的藥物在本質上具有高度的親脂性。這種親脂性活性成分在藥物遞送位點和靶位點的摻入和遞送一直是一個值得關注的問題。結果表明，采用熔融乳化超聲法將DST 制備成納米結構脂質載體，能有效克服DST 水難溶性的問題。此外，可以推測，如果獲得納米范圍的顆粒，生物利用度可能會增加。因此，NLC 被用作親脂性藥物的藥物載體，通過納米顆粒提高水難溶性的藥物DST 的生物利用度。