miR-130a在老年骨折患者血清中的表達水平及對骨髓間充質干細胞成骨分化的調控▲

蘇海濤 陳 海 湛 川

(廣西玉林市第一人民醫院1 急診科，2 骨科，玉林市 537000；3 中國醫科大學附屬第四醫院骨二科，遼寧省沈陽市 110032)

骨折是常見的骨科疾病，老年人骨折多因骨質疏松引起，老年人骨質較為脆弱，稍受外力即可發生骨折。骨折一般采用手術治療，但術后愈合時間長，恢復過程復雜，機體需要產生大量骨細胞以加快骨質的合成和鈣化[1]。成骨細胞由分化和增殖能力強、取材廣泛的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)分化而來，在骨愈合過程中可合成骨基質[2]。研究BMSC的分化特性可以更好地指導其在骨折患者中的應用[3]。研究顯示，BMSC的分化在骨質形成中容易受到炎癥、藥物等多種因素的影響[4]。許多miRNA被證實參與了骨質形成的過程[5]，其中miR-130a可以調控關節軟骨細胞的增殖和分化[6]，但其在骨折患者中的表達情況及相關研究較少。Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)是促進BMSC向成骨細胞分化的特異性轉錄調節因子，其通過調控成骨細胞特異性細胞外基質蛋白基因的表達和成骨細胞周期參與成骨細胞的分化過程，促進骨形成和抑制骨吸收[7]。而miR-130a是否在骨折患者中表達，以及是否可以通過RUNX2對BMSC的分化進行調控，還尚不清楚。本研究探討miR-130a在老年骨折患者血清中的表達水平及其通過RUNX2對BMSC的分化調控作用，為臨床治療老年骨折患者提供研究基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年4月至2020年4月在廣西玉林市第一人民醫院治療的40例老年脛骨骨折患者作為觀察組，男性24例、女性16例，年齡60～71(64.2±11.3)歲。所有患者均經體格檢查及影像學檢查確診為脛骨骨折，并接受手術治療，均無骨質疏松、惡性腫瘤、嚴重心腦血管疾病等，入院前均未服用激素類藥物。選擇同期40名健康體檢者為對照組，排除骨質疏松、腫瘤、嚴重心腦血管疾病等，其中男性22例、女性18例，年齡61～73(64.5±12.4)歲。兩組研究對象的性別、年齡比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。具有可比性。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究通過廣西玉林市第一人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 胎牛血清(貨號：12676-029)、PBS(貨號：02-024-1ACS)、TRIzol試劑盒(貨號：DP501)均購自天根生化科技(北京)有限公司；IP細胞裂解液(貨號：PS0009)購自江萊生物公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒(貨號：PC0020)購自北京索萊寶科技有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒(批號：FSR22266)購自上海撫生實業有限公司。苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)裂解液(北京普利萊基因技術有限公司，批號：C1055-100)；鼠抗人RUNX2單克隆抗體(貨號： H00000860-M01)、鼠抗人堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP；貨號：E-EL-R0057)、鼠抗人骨鈣素(貨號：PL03-0470R)均購自上海易匯生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(貨號：JN0201-UXM)購自北京百奧萊博科技有限公司；GAPDH抗體(貨號：BTN130593-JVC)購自北京百奧萊博科技有限公司；人BMSC(貨號：GD-C819059)購自廣州賽業生物科技有限公司；ECL試劑盒(貨號：P0018S)購自上海哈靈生物科技有限公司。茜素紅(貨號：BTN121105)購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養與轉染：復蘇BMSC后，將其置于DMEM完全培養基，在37 ℃、5% CO2、100%濕度培養箱中培養至3代。按3×105個/孔密度接種在96孔板，將細胞分為對照組、成骨誘導組、NC組、miR-130a增強組、miR-130a抑制劑組進行實驗。對照組和成骨誘導組不做轉染處理，NC組轉染miRNA-NC，miR-130a增強組轉染模擬高表達miR-130a的miR-130a mimics，miR-130a抑制劑組轉染模擬低表達miR-130a的miR-130a inhibitor。轉染質粒由南京堯順禹生物科技有限公司構建。用150 μL減血清培養基(Opti-minimal essential medium,Opti-MEM)(賽默飛公司，批號：51985091)稀釋3 μL脂質體(美國Invitrogen公司，批號：11668-027)，室溫放置5 min；用150 μL Opti-MEM稀釋5 μL相應質粒(終濃度為100 nmoL/L)；將上述兩者溶液混合后室溫下放置20 min，將混合液均勻滴于6孔板中，37 ℃、5% CO2條件下采用Opti-MEM培養基進行培養4～6 h后，換回正常DMEM完全培養基繼續于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，供后續實驗使用。轉染24 h后進行成骨誘導。

1.3.2 成骨誘導：對成骨誘導組和各轉染組細胞進行成骨誘導。細胞轉染后，待細胞融合度達70%～80%時，更換成骨誘導液(10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、1×10-5mmol/L地塞米松、50 μg/mL維生素C)，37 ℃、5% CO2保溫箱繼續培養，記為第1天，后每隔1 d換液培養。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測miR-130a和RUNX2 mRNA相對表達量：采集觀察組患者術后1周、對照組研究對象健康體檢時的靜脈血5 mL，室溫下以1 000 r/min離心10 min后收集上清液，置于-80 ℃保存待測。收集成骨誘導第7天時各組細胞，采用實時熒光定量PCR方法檢測血清及BMSC的miR-130a、RUNX2 mRNA表達量。

按照TRIzol試劑盒(上海梵態生物科技有限公司，批號：FT30506yy)說明書提取血清、BMSC中的總RNA。按反轉錄試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司，批號：YT9036)將RNA反轉錄為cDNA。按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行反應體系的配制，反應體系包括SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL、Primer Mix(10 μm)1.6 μL、cDNA 1.5 μL、dH2O 6.9 μL。反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃ PCR反應5 s,60 ℃ 30 s，重復40次。miR-130a引物序列見表1。以U6、GAPDH為內參，采用比較CT值法對獲得的數據進行相對定量分析。實驗重復3次。

表1 引物序列表

1.3.4 Western blot檢測RUNX2、ALP、骨鈣素蛋白表達量：成骨誘導第7天時，收集各組細胞，使用PBS清洗1次，常溫下800～1 000 r/min離心3～5 min后棄上清，重復2～3次。加入PMSF裂解液后在冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，收集上清液在-20 ℃下保存。使用BCA試劑盒檢測樣本總蛋白含量，每孔加入待測蛋白40 μg進行SDS-PAGE，轉膜后使用鼠抗人RUNX2(1 ∶500)、ALP(1 ∶500)、骨鈣素(1 ∶500)、GAPDH1(1 ∶500)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜 3次，每次3 min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體(1 ∶1 000)，室溫搖床上輕搖孵育1 h。加入ECL試劑，顯影、定影，用凝膠圖像處理系統分析條帶灰度值，以GAPDH為內參，計算目的蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.3.5 ALP染色：在成骨誘導第7天時進行ALP染色。將各組細胞用冷純丙酮在-4 ℃環境下固定24 h后，蒸餾水沖洗、瀝干，加入孵育液(5 mL 3%甘油磷酸鈉、1 mL 2%硫酸鎂、5 mL 2%巴比妥鈉、10 mL 2%氯化鈣、蒸餾水10 mL)孵育3 h；取出培養瓶后用蒸餾水沖洗，加入2%硝酸鈷處理2 min，加入1%硫化銨2 min處理1 min，用PBS沖洗后干燥，顯微鏡下觀察及照片。染色后細胞核染為紅棕色，ALP陽性細胞的胞漿為藍色。

1.3.6 礦化物結節染色(茜素紅染色法)：在成骨誘導第21天時對各組細胞進行茜素紅染色。取12孔板，每孔加PBS沖洗，加2 mL 4%中性甲醛固定30 min，每孔加1 mL 0.1%茜素紅染液染3～5 min，采用10%氯化十六烷基吡啶洗脫茜素紅，吸走茜素紅染液后用PBS沖洗2～3次，干燥培養板，顯微鏡下觀察紅色點狀礦化結節并拍照，ImageJ 1.48軟件計算礦化面積比例。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。計量資料采用(x±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料采用例數和百分比表示，比較采用χ2檢驗；采用Pearson檢驗分析觀察組血清miR-130a表達量與RUNX2 mRNA表達量的相關性。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組研究對象血清miR-130a、RUNX2 mRNA表達量的比較 觀察組血清miR-130a表達量低于對照組，血清RUNX2 mRNA表達量高于對照組(均P<0.05)，見表2。Pearson相關性分析顯示，觀察組患者血清miR-130a表達量與RUNX2 mRNA表達量呈負相關(r=-0.538，P=0.020)。

表2 兩組研究對象血清miR-130a、RUNX2 mRNA相對表達量的比較(x±s)

2.2 5組BMSC中miR-130a及RUNX2、ALP、骨鈣素蛋白表達量的比較 成骨誘導組細胞中miR-130a表達量低于對照組，RUNX2、ALP、骨鈣素蛋白表達量均高于對照組(均P<0.05)。miR-130a增強組細胞中miR-130a表達量高于成骨誘導組和NC組，RUNX2、ALP、骨鈣素蛋白表達量均低于成骨誘導組和NC組(均P<0.05)；miR-130a抑制組細胞中miR-130a表達量低于轉染NC組和miR-130a增強組，RUNX2、ALP、骨鈣素蛋白表達量均高于成骨誘導組、NC組和miR-130a增強組(均P<0.05)。見表3、圖1。

表3 5組BMSC中miR-130a及RUNX2、ALP、骨鈣素蛋白相對表達量的比較(x±s)

圖1 蛋白條帶圖

2.3 BMSC分化情況 BMSC成骨誘導第7天時，經ALP染色的成骨誘導組細胞出現大量棕黑色或黑色顆粒，胞漿染色呈深藍色，細胞已經開始成骨分化，見圖2。成骨誘導第21天時，經茜素紅染色的成骨誘導組細胞出現深紅色點狀礦化結節，形成片狀礦化結節，miR-130a增強組礦化面積比例低于成骨誘導組、NC組，miR-130a抑制組礦化面積比例高于成骨誘導組、NC組和miR-130a增強組(均P<0.05)，見表4、圖3。

圖2 成骨誘導后的BMSC(ALP染色，×200)

表4 4組BMSC細胞礦化面積比例的比較(x±s，%)

圖3 茜素紅染色結果(×200)

3 討 論

BMSC是一類具有自我更新和多向分化潛能的干細胞，可以在不同誘導條件下分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌腱細胞、骨髓基質和神經膠質細胞等[8]。BMSC在成骨能力方面表現突出，其可在體內或體外誘導分化為成骨細胞，可為骨缺損的修復和成骨缺陷疾病的治療提供支持[9]。但在老年人中，老化的BMSC成骨分化能力減弱，因此抑制BMSC老化并促進BMSC成骨分化可為提高老年骨骼質量提供重要的研究途徑。

miRNA是參與各種基因調控過程的非編碼小RNA，其不僅可以參與細胞的增殖、分化、凋亡等過程，還能夠調節細胞的多向分化[10]。隨著研究的不斷深入，越來越多的證據表明miRNA與骨關節炎、骨質疏松癥等多種骨疾病的發生和發展密切相關。研究表明，miRNA參與調控BMSC的成骨分化過程，但參與調控BMSC成骨分化的通路及具體作用機制尚未完全清楚[11-12]。miR-130a被證實在多種疾病中表達異常，例如，孫強等[13]研究發現，半月板損傷的患者軟骨組織中miR-130a-3p表達降低，可增強軟骨組織的細胞增殖。還有學者在BMSC 向軟骨細胞分化的過程中檢測到miR-130a表達降低[14]。本研究結果顯示，觀察組血清miR-130a表達量低于對照組，血清RUNX2 mRNA表達量高于對照組，體外細胞實驗結果顯示，成骨誘導組細胞中miR-130a表達量低于對照組(均P<0.05)，這提示miR-130a參與了骨折的修復過程，可能與成骨細胞的分化過程有關。

成骨細胞分化是骨愈合的關鍵，成骨細胞是骨形成過程中的重要功能細胞，來源于未分化并具有多潛能的間充質干細胞。在多種因子的作用下，BMSC可分化為不同類型的細胞。RUNX2基因在成骨細胞分化和骨形成中起重要作用，適度的RUNX2表達可調控BMSC向成骨細胞分化的過程[15-16]。有研究顯示，在成骨細胞分化的過程中，RUNX2呈高表達狀態，而RUNX2基因的表達受到多種miRNA(包括miR-155、miR-103-3p、miR-132等)的調控[17-19]。ALP和骨鈣素是成骨分化的標志基因，常用于反映成骨細胞的分化程度[20]。本研究中，成骨誘導后的BMSC的RUNX2、ALP、骨鈣素蛋白表達均上調，與上述研究結論相符。上調miR-130a后，經成骨誘導的BMSC的RUNX2、ALP、骨鈣素蛋白表達量較經單純成骨誘導的細胞降低，且茜素紅染色顯示成骨細胞分化程度降低；而抑制miR-130a表達后，經成骨誘導的BMSC的RUNX2、ALP、骨鈣素蛋白表達量升高，茜素紅染色顯示礦化結節明顯，成骨細胞分化程度高；同時相關性分析顯示觀察組患者血清miR-130a表達量與RUNX2 mRNA表達量呈負相關。由此推測，miR-130a可以通過調節RUNX2的表達實現對成骨細胞分化過程的調控，其中miRNA-130a低表達可通過上調RUNX2表達水平來促進成骨細胞分化[20]。

綜上所述，miR-130a在老年骨折患者血清中的表達降低，低表達水平的miR-130a可通過上調RUNX2的表達來促進BMSC的成骨分化。