柑橘黑點病菌種群對嘧菌酯敏感性基線的建立

曾雅婷, 熊 桃, 柏自琴, 譚振華, 李紅葉*

(1. 浙江大學生物技術研究所, 杭州 310058; 2. 貴州省農業科學院果樹科學研究所, 貴陽 550006; 3. 湖南省宜章縣農業農村局, 郴州 424200)

柑橘黑點病又名砂皮病和樹脂病,主要由柑橘間座殼Diaporthecitri引起,是危害柑橘的主要真菌性病害之一,對果實外觀品質和銷售價格影響很大。目前柑橘黑點病的主要防治措施是剪除銷毀枯枝,以減少侵染來源,和噴藥保護。但由于果園可源源不斷產生枯枝,而勞動力成本有限,很難通過徹底剪除銷毀枯枝,實現病害控制。因此，針對目前我國柑橘的栽培現狀以及黑點病的發生規律,噴藥保護仍然是當前控制柑橘黑點病的必要手段。代森錳鋅是防治柑橘黑點病的有效藥劑,具有價格便宜、使用方便、防治效果好等優點,在柑橘生產上廣泛應用[1]。但有研究指出長期接觸代森錳鋅會導致多巴胺能神經元功能受損,如使用6 μmol/L Mn-EBDC(代森錳鋅主要活性成分乙基二硫代氨基甲酸錳)處理多巴胺能神經元細胞,7 d后不僅產生明顯的神經毒性,還抑制了胰凝乳蛋白酶和谷氨酰肽酶的活性,Mn-EBDC也能夠引起鼠類的選擇性黑紋狀體神經變性,可能與帕金森等神經性退化疾病有關[2]。

以作物為“柑橘”,防治對象為“樹脂病/砂皮病/黑點病”在中國農藥信息網(http:∥www.icama.org.cn/)上搜索可知,除代森錳鋅以及代森錳鋅的復配劑外,目前在我國登記用于柑橘黑點病防治的藥劑有氟啶胺、氟硅唑、克菌丹、咪鮮胺和吡唑醚菌酯,以及一些復配劑如苯甲·克菌丹、唑醚·戊唑醇和肟菌·戊唑醇等。防效對比試驗表明,克菌丹、氟硅唑、咪鮮胺的田間防治效果均不及代森錳鋅[1,3-4]。雖然離體條件下氟啶胺對黑點病菌具有強烈的抑制效果,但田間防治效果不及代森錳鋅,而且成本遠高于代森錳鋅[5]。因此必需篩選和引入一些低毒高效殺菌劑,取代代森錳鋅或與代森錳鋅交替使用。

嘧菌酯(azoxystrobin)是近年發展起來的一種新型的甲氧基丙烯酸酯(QoI)類殺菌劑,通過作用于病原真菌線粒體電子傳遞鏈的復合體Ⅲ,與細胞色素b(cytb)的Qo位點結合,阻礙細胞色素b和c1間的電子傳遞,干擾細胞能量形成而起到殺菌作用[6]。嘧菌酯的殺菌譜廣,不但能夠抑制菌絲生長,還具有抑制產孢的作用,安全低毒,而且與三唑類、苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、苯酰胺類等殺菌劑沒有交互抗性[7]。嘧菌酯在美國被登記用于柑橘黑點病的防治[8],在我國已被登記用于柑橘瘡痂病(致病菌為Elsino?fawcettii)和炭疽病(致病菌為Colletotrichumgloeosporioides)的防治,與之作用機制相同的吡唑醚菌酯最近登記用于柑橘黑點病的防治(中國農藥信息網http:∥www.icama.org.cn/),農藥廠家也開始推薦嘧菌酯在柑橘黑點病防治中使用。

然而,嘧菌酯和吡唑醚菌酯都是單作用位點殺菌劑,靶標位點發生自發性突變的頻率較高,在高選擇壓力下,容易誘導抗性群體頻率上升[9]。自1996年QoI類殺菌劑用于禾谷類作物后,2年內就發現了抗QoI的小麥白粉病菌菌系[10],之后其他病菌也出現了抗藥性問題。如孟潤杰等報道了河北黃瓜霜霉病菌Pseudoperonosporacubensis對嘧菌酯的抗性頻率達到了100%[11]。因此,在應用此類殺菌劑之前,測定黑點病菌種群對嘧菌酯的敏感基線對今后監測病菌種群抗藥性的發展和科學用藥具有現實意義。為此,本研究對來自浙江、湖南、江西、貴州4個柑橘產區黑點病菌群體對嘧菌酯的敏感性展開研究,確定其敏感基線,以期為嘧菌酯的科學使用及抗藥性控制方法提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2019年從湖南、江西和貴州柑橘種植區采集柑橘葉片、果實和枝干的黑點病樣本，經組織分離獲得43株柑橘黑點病菌菌株，其中17株來自湖南湘西(11株來自 ‘椪柑’， 6株來自 ‘紐荷爾臍橙’)，14株來自貴州從江(10株來自 ‘椪柑’， 4株來自 ‘紐荷爾臍橙’)，12株來自江西宜春(9株來自 ‘椪柑’， 3株來自 ‘紐荷爾臍橙’)。浙江產區的23個菌株為本實驗室保存，其中的12個菌株來源于浙江衢州的‘椪柑’，11個菌株來源于浙江臺州的‘本地早’和‘溫州蜜柑’。

1.2 供試藥劑與培養基

98%嘧菌酯原藥由江蘇如東眾意化工有限公司提供,99%水楊肟酸(salicylhydroxamic acid,SHAM)購自江蘇艾康生物醫藥研發有限公司。試驗用的培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)和水瓊脂培養基(WA)。

1.3 試驗方法

1.3.1柑橘黑點病菌的分離和鑒定

取采自湖南、江西、貴州的‘紐荷爾臍橙’和‘椪柑’帶典型黑點病的葉片、果實或枝干樣品,采用常規的組織分離法分離菌株[12]。所有菌株經形態學觀察初步鑒定為Diaporthe屬后,進一步使用柑橘黑點病菌特異性引物Dc-F(5′-CCCTCGAGGCATCATTAC-3′)和Dc-R(5′-ATGTTGCAGATGGTCAAATGG-3′)(待發表)進行菌株的鑒定。所有經鑒定為柑橘黑點病菌的菌株保存于4℃條件下備用。

1.3.2含藥培養基的制備

將嘧菌酯溶于無水乙醇,配制成100 μg/mL母液,再用無水乙醇稀釋成不同濃度梯度藥液,取適量藥液加入約50℃的PDA培養基中,充分混勻,配成系列濃度梯度的含藥培養基,以未加藥培養基作為對照。在配制含藥培養基時,還需要在各濃度(包括空白對照)PDA培養基中加入100 μL SHAM(使用甲醇溶解配制使其終深度為100 μg/mL),以抑制病原真菌的旁路氧化作用[13]。

1.3.3菌絲生長對嘧菌酯的敏感性

使用菌絲生長抑制法測定不同地區柑橘黑點病菌對嘧菌酯的敏感性,嘧菌酯的質量濃度分別設為0、0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、25 μg/mL。菌株在PDA中培養7 d左右,在菌落邊緣打取0.5 cm菌碟,接種到含不同濃度嘧菌酯及100 μg/mL SHAM的PDA中,每個濃度重復3次,25℃培養7 d后使用十字交叉法測量菌落直徑,按公式(1)計算菌絲生長抑制率。

1.3.4孢子萌發對嘧菌酯的敏感性

待黑點病菌在PDA上培養30 d,產孢后收集分生孢子,用無菌水配制成1×105個/mL的孢子懸浮液,在含有100 μg/mL SHAM的WA培養基中分別加入濃度為0、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2 μg/mL的嘧菌酯,配制成系列濃度梯度的水瓊脂平板。取80 μL孢子懸浮液分別均勻涂布在平板上,于25℃培養12 h后,在顯微鏡下觀察并記錄孢子萌發情況,芽管長度超過孢子寬度者視為萌發。每個藥劑濃度取5個不同視野,每個視野隨機檢測至少20個孢子,每個處理3次重復。按公式(3)計算孢子萌發抑制率。

1.4 數據處理

將藥劑濃度換算成濃度對數(X),抑制率換算成抑制幾率值(Y),使用DPS 9.01統計軟件計算嘧菌酯對柑橘黑點病菌的毒力回歸方程Y=a+bX、相關系數及有效中濃度EC50。

通過Excel軟件對測定的各菌株EC50進行分組。采用公式(4)確定組距,以a為下限,統計各組的菌株數;同時以EC50為X軸,菌株數為Y軸,得到柑橘黑點病菌種群對嘧菌酯的敏感性分布圖。使用Excel進行正態分布檢驗,當EC50處于正態分布時,菌絲生長抑制法和孢子萌發抑制法測得的EC50平均值即可分別作為它們對嘧菌酯的敏感性基線。

菌絲生長抑制率=

(1)

(2)

孢子萌發抑制率=

(3)

組距=(b-a)/m

(4)

(4)式中,a:略小于樣本數據的最小值,b:略大于樣本數據的最大值,m:分組數。

2 結果與分析

2.1 柑橘黑點病菌菌株的分離

分離純化并使用特異性引物Dc-F和Dc-R對菌株進行鑒定后,共獲得柑橘黑點病菌菌株43株,其中湖南17株,江西12株,貴州14株,由本實驗室保存的來自浙江柑橘產區的柑橘黑點病菌菌株23株。所有菌株將用于后續對殺菌劑的敏感性測定。

2.2 不同地區柑橘黑點病病菌種群菌絲生長對嘧菌酯的敏感性

使用菌絲生長抑制法測定柑橘黑點病菌對嘧菌酯的敏感性,發現4個省份的菌株敏感性存在一定差異,EC50在0.057 6～0.709 μg/mL(表1)。其中,浙江的菌株敏感性最高,EC50平均值為0.197 9 μg/mL;湖南的菌株敏感性最低,EC50平均值為0.279 μg/mL,約為浙江的1.41倍。

表1 不同省份柑橘黑點病病菌種群菌絲生長對嘧菌酯的敏感性1)Table 1 Sensitivity of Diaporthe citri population from different provinces to azoxystrobin in terms of mycelial growth

2.3 黑點病菌種群菌絲生長對嘧菌酯的敏感性頻次分布

通過采用菌絲生長抑制法對4個省份的66個柑橘黑點病菌菌株進行敏感性測定發現,EC50最高為0.709 μg/mL(Y=0.752 5X+5.112 4,R2=0.974 1),最低為0.057 6 μg/mL(Y=2.354 3X+7.918 2,R2=0.860 7),最高值比最低值高11.31倍,平均EC50為(0.228 5±0.113 8)μg/mL。將EC50劃分為10組,設0.05 μg/mL為下限,0.75 μg/mL為上限,從而求得組距為0.07 μg/mL。統計各組的菌株數,得到菌株敏感性頻次分布圖(圖1),發現在測定的菌株中,EC50主要集中分布在0.12～0.33 μg/mL,小于0.5 μg/mL,表明嘧菌酯對柑橘黑點病菌的菌絲生長有明顯的抑制活性。敏感性頻次分布曲線為單峰連續曲線,符合正態分布。因此可將其平均EC50作為柑橘黑點病菌菌絲生長對嘧菌酯的敏感性基線。

圖1 柑橘黑點病菌種群菌絲生長對嘧菌酯的敏感性頻次分布Fig.1 Sensitivity frequency distribution of Diaporthe citri population to azoxystrobin in terms of mycelial growth

根據FAO[14]標準,抗性突變體的EC50比敏感菌株高5～10倍,可以將柑橘黑點病菌菌絲生長對嘧菌酯的抗性水平按以下標準劃分:1.142 5≤EC50<5.712 5 μg/mL為低抗(LR);5.712 5≤EC50<28.562 5 μg/mL為中抗(MR);EC50≥28.562 5 μg/mL為高抗(HR)。根據抗性分級標準,在菌絲生長速率的測定中,未出現抗嘧菌酯的柑橘黑點病菌菌株。

2.4 不同省份柑橘黑點病菌種群孢子萌發對嘧菌酯的敏感性

由表2可知,不同柑橘產區菌株孢子萌發對嘧菌酯的敏感性存在一定差異。其中,江西菌株敏感性最高,EC50平均值為0.023 μg/mL;貴州菌株敏感性最低,EC50平均值為0.028 9 μg/mL,約為江西的1.26倍。

表2 不同省份柑橘黑點病菌種群孢子萌發對嘧菌酯的敏感性Table 2 Sensitivity of Diaporthe citri population from different provinces to azoxystrobin in terms of conidial germination

2.5 黑點病菌種群孢子萌發對嘧菌酯的敏感性頻次分布

采用孢子萌發抑制法對66株柑橘黑點病菌進行敏感性測定發現,嘧菌酯對柑橘黑點病菌孢子萌發的EC50均低于0.1 μg/mL,最高為0.052 7 μg/mL(Y=1.207X+6.542 6,R2=0.984 2),最低為0.011 4 μg/mL(Y=4.895 3X+14.517,R2=0.894 2),平均EC50為(0.025 6±0.006 9)μg/mL,最高值比最低值高3.63倍。將EC50劃分為10組,設0.01 μg/mL為下限,0.06 μg/mL為上限,從而求得組距為0.005 μg/mL。統計各組的菌株數,制作黑點病菌菌株敏感性頻次分布圖(圖2)。測定的菌株中,EC50分布主要集中在0.025～0.03 μg/mL,可見嘧菌酯對柑橘黑點病菌的孢子萌發也有很強的抑制活性。敏感性頻次分布曲線為連續單峰曲線,符合正態分布。因此可將其平均EC50[(0.025 6±0.006 9) μg/mL]作為柑橘黑點病菌孢子萌發對嘧菌酯的敏感性基線。

圖2 柑橘黑點病菌種群孢子萌發對嘧菌酯的敏感性頻次分布Fig.2 Sensitivity frequency distribution of Diaporthe citri population to azoxystrobin in terms of conidial germination

同理,根據FAO[14]標準,可將柑橘黑點病菌孢子萌發對嘧菌酯的抗性水平按以下標準劃分: 0.128≤EC50<0.64 μg/mL為低抗(LR),0.64≤EC50<3.2 μg/mL為中抗(MR),EC50≥3.2 μg/mL為高抗(HR)。根據抗性分級標準,在孢子萌發的測定中,未出現抗嘧菌酯的柑橘黑點病菌菌株。

3 結論與討論

使用藥劑防治植物病害具有使用方便、見效快等優點,但是頻繁使用同一作用機制的殺菌劑容易誘導病原菌對該類殺菌劑產生抗性,從而使得防治效果大為降低甚至喪失。及時監測病菌種群抗性發展動態,調整用藥方案,是病害得以有效控制的前提,而建立病原菌種群對殺菌劑的敏感性基線是進行抗藥性監測的基礎[15]。Mondal等[16]采用菌絲生長速率法測定了美國柑橘黑點病菌對嘧菌酯的敏感性,發現嘧菌酯對柑橘黑點病菌有很強的抑制作用,并建立了病菌種群對嘧菌酯的敏感性基線,其ED50為0.08 μg/mL。本研究分別采用菌絲生長抑制和孢子萌發抑制法測定了來自湖南、江西、貴州和浙江的柑橘黑點病菌種群對嘧菌酯的敏感性,建立了我國黑點病菌種群對嘧菌酯的敏感性基線,發現中國柑橘黑點病菌種群對嘧菌酯也具有很高的敏感性,其抑制菌絲生長和分生孢子萌發的敏感性基線(EC50)分別為0.228 5 μg/mL和0.025 6 μg/mL,可見不同地理種群菌株對嘧菌酯的敏感性存在差異[16]。敏感基線的建立為將來監測我國柑橘黑點病菌種群對嘧菌酯等QoI類殺菌劑的抗性奠定了基礎。

黑點病菌侵入柑橘果實、葉片和枝梢后很快誘導寄主的防衛反應,分泌植保素6,7-二甲氧基香豆素(6,7-dimethoxy coumarin),受侵染細胞及其周圍少量細胞快速死亡,外圍細胞增生,在病健組織間形成周皮,限制病菌的擴展,保護健康組織的正常生理活動[17]。研究發現一些內吸性殺菌劑,如苯菌靈和腈苯唑在病菌侵染后施用很難發揮其治療作用,因此黑點病的防治應注重預防,選擇在病菌侵染前能抑制病原菌孢子萌發的藥劑其防治效果更佳[18]。嘧菌酯是一種兼具保護和治療作用的QoI類殺菌劑,殺菌譜廣,在美國已被登記用于柑橘黑點病的防治[8],本研究結果表明,我國柑橘黑點病菌種群對嘧菌酯敏感,可登記用于黑點病的防治。

雖然QoI殺菌劑的殺菌譜廣,與環境相容良好[7],但因其作用位點單一,病菌極易對該類藥劑產生抗性[9-11]。因此,本研究所建立的敏感基線可為將來監測柑橘黑點病菌種群對嘧菌酯敏感性的變化動態,及時調整用藥方案奠定基礎,同時建議使用嘧菌酯防治柑橘黑點病時和其他不同作用機制的殺菌劑輪換使用。