油菜葉片性狀及次生代謝物質與其對黃寬條跳甲抗性的關系及對跳甲解毒酶活性的影響

郝江寧, 常 靜, 李 妍, 馮建雄, 李海平

(內蒙古農業大學園藝與植物保護學院, 呼和浩特 010019)

植物外部形態特征對害蟲取食具有深遠的影響,植食性昆蟲對寄主植物的發現和選擇包括定向和定位兩個行為過程,昆蟲的觸覺和味覺對其定位和取食選擇寄主植物起主要作用,寄主植物的外部形態及揮發性物質在植食性昆蟲對寄主植物的定向過程中起著關鍵性作用[1]。

植物葉片表皮蠟質是植物地上部分與外部環境的分界線,在植物對病原物的有效防御機制中,表皮蠟質被認為是第一道防線[2]。植物葉片上的蠟質結構影響葉片表面的光滑程度,蠟質含量對葉片顏色也會產生一定的影響,從而影響植食性昆蟲的寄主選擇。Bodnaryk發現蔬菜黃條跳甲Phyllotretacruciferae對光滑卷心菜的為害遠大于非光滑型卷心菜[3]。茸毛是植物葉部形態特征之一,茸毛的密度和長短對昆蟲附著、取食和產卵有重大的影響。劉奕清等研究茶樹葉片茸毛對側多食跗線螨Polyphagotarsonemuslatus的抗性機制,發現茶樹葉片茸毛所形成的機械屏障,使側多食跗線螨的口針長度達不到取食部位[4]。對蚜蟲有抗性的高粱葉片表面茸毛稀且較長[5]。植物的茸毛結構是否能夠表現出抗蟲性并不是絕對的。

植物次生物質的種類和含量與植物抗蟲性也密切相關。目前已知與植物抗蟲性相關的植物次生代謝物質包括生物堿、酚類、萜烯類等[6]。植物次生代謝物質具有毒殺、驅避昆蟲、使其拒食、抑制昆蟲生長發育等作用。張永軍等發現,棉花的次生代謝物質縮合單寧能抑制棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的生長發育和取食,并對許多刺吸式口器害蟲有明顯抗蟲效果[7]。陳巨蓮等發現,抗蟲性小麥品種中單寧酸、總香豆素是其抗麥長管蚜Sitobionmiscanthi的主要次生代謝物質[8]。野生番茄含有的黃酮類化合物可以減少植食性昆蟲對葉片的損傷[9-10]。番茄中含有的黃酮對煙粉虱Bemisiatabaci產卵有一定抑制作用,黃酮類含量高的品種對煙粉虱有驅避作用[11]。植物次生代謝物質可以防御植食性昆蟲的為害,在植物抗蟲機制中起著重要的作用。另一方面,植食性昆蟲在與植物的協同進化中形成了以抗氧化酶和解毒酶為基礎的代謝機制,應對各種生物脅迫,維持正常的生長發育和繁殖[12]。但關于這些物質對甲蟲類的影響研究報道很少。

黃寬條跳甲Phyllotretahumilis是春油菜苗期的主要害蟲,對油菜生產危害很大。作者在前期研究中已經篩選出了2個對黃寬條跳甲有抗性的油菜品種‘太空蒙Ⅳ’和‘大黃油菜’,1個感蟲品種‘青油14’。在此基礎上,本研究主要檢測了這幾個油菜品種葉片性狀及次生代謝物質在對黃寬條跳甲抗蟲性中的作用及對黃寬條跳甲解毒酶活性的影響,為未來油菜抗蟲育種研究提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試油菜

本試驗共選用3個油菜品種,分別為甘藍型油菜Brassicanapus‘青油14’和‘太空蒙Ⅳ’,芥菜型油菜B.juncea‘大黃油菜’。實驗室前期研究工作已經明確‘太空蒙Ⅳ’與‘大黃油菜’為抗黃寬條跳甲品種,‘太空蒙Ⅳ’的抗蟲性高于‘大黃油菜’;‘青油14’為感蟲品種。

選取健康、飽滿的3個品種油菜種子,分別均勻播種于花盆中(直徑20 cm)。每盆播種20粒種子。出苗2周后取樣。

1.2 供試蟲源

黃寬條跳甲成蟲采自內蒙古呼和浩特市武川縣哈樂鎮十字花科雜草獨行菜Lepidiumapetalum上。黃寬條跳甲成蟲越冬結束后,首先選擇發芽較早的獨行菜為害,當油菜出苗后轉移到油菜上為害。

1.3 試劑及藥品

沒食子酸標準品，α-乙酸萘酯(α-NA)，α-萘酚，固藍B鹽，毒扁豆堿，牛血清白蛋白(BSA)， 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)，還原型谷胱甘肽(GSH)，Macklin 公司；蘆丁標準品和荷葉堿標準品，Sigma化學試劑公司；考馬斯亮藍G-250，Fluka 公司。其他試劑均為國產分析純。

1.4 油菜幼苗葉片含水量和蠟質含量測定

油菜葉片含水量測定參照薛俊杰的方法[13]。分別選取3個油菜品種的新鮮幼苗葉片各1 g,放入事先稱重的培養皿中,置于80℃烘箱內迅速殺青至重量不再變化,稱重后減去培養皿重則為葉片干重,每品種重復3次,以單位鮮葉重計算葉片含水量。

蠟質含量測定參照 Bewick等的方法[14]。分別選取3個油菜品種新鮮幼苗葉片5 g,置于燒杯中,倒入80 mL三氯甲烷浸泡葉片1 min,取出葉片后將溶液置于事先稱重的蒸發皿中,在通風柜中使三氯甲烷自然揮發完畢且蒸發皿恒重后稱量, 稱量后所得數值減去蒸發皿重量即為蠟質重量,每品種重復3次,以單位鮮葉重計算蠟質含量。

1.5 油菜葉片茸毛密度及長度的測定

選取出苗2周的3個品種油菜最頂端葉片各10片,使用奧林巴斯(OLYMPUS) CX21型生物顯微鏡觀察油菜葉片正反面表面茸毛。參照郭廣君等的方法[15]測定油菜葉片葉脈兩側對稱位置單位面積下的茸毛數量,計算茸毛密度。同時測量茸毛長度。

1.6 油菜次生代謝物含量測定

油菜可溶性單寧含量測定采用Folin-Ciocalteu法[16]。取3個品種油菜葉片各0.5 g制備單寧提取液。吸取0.5 mL提取液置于10 mL試管中,先加入2.5 mL 10倍福林酚稀釋溶液,再加入2 mL 7.5%碳酸鈉溶液,搖勻,靜置30 min,在760 nm處測定吸光度。用單寧酸制作標準曲線,計算可溶性單寧含量。

總酚測定采用Folin-Ciocalteu比色法(FC酚法)[17]。稱取3個品種油菜葉片各0.5 g,研磨后放入預冷離心管中,加入0.1 mL 10%三氯乙酸,加無水乙醇定容至5 mL,靜置30 min,5 000 g下離心10 min,取上清液待用。取乙醇提取液0.5 mL于25 mL容量瓶中,加入9.5 mL蒸餾水,搖勻,加入FC試劑0.5 mL混勻,在0.5～8 min內加入1.5 mL 20%的Na2CO3溶液,充分混合后定容,30℃避光放置0.5 h,760 nm下測定吸光度,以蒸餾水為空白對照。每個樣品平行測3次。以沒食子酸為標準品,制作標準曲線。

黃酮含量的測定參考王金亭等的方法[18]。將油菜幼苗放入60℃烘箱中干燥5 h后研磨成粉末,稱取油菜粉末10 g加入70 mL 95%乙醇,在60℃超聲120 min,靜置過夜,過濾后用石油醚作溶劑萃取2次,除去脂溶物。除脂后用旋轉蒸發儀濃縮,用40%乙醇定容至100 mL。準確稱取2 mL樣品液到10 mL具塞試管中,加入40%乙醇溶液約3 mL 及5% NaNO2溶液0.3 mL,搖勻。放置5 min 后加入10%硝酸鋁0.3 mL,搖勻;5 min后加入1 mol/L NaOH溶液4 mL及蒸餾水0.4 mL,搖勻;放置15 min,于510 nm波長下測定吸光度,每個樣品平行測3次。以蘆丁制作標準曲線,計算黃酮的含量。

生物堿的測定參考蔡永萍的方法[19]。將油菜幼苗放入60℃烘箱中干燥5 h后研磨成粉末。油菜粉末用40%乙醇進行超聲波提取,溫度為50℃,料液比1∶25(g/mL),提取時間為75 min。取2 mL樣品溶液于5 mL容量瓶,加三氯甲烷定容至5 mL,振搖,移至分液漏斗中,準確加入溴甲酚綠緩沖液和0.2 mol/L NaOH各1 mL,搖勻,靜置,取澄清的三氯甲烷萃取液在415 nm波長處進行測定,每個樣品平行測3次。以荷葉堿為標準品制作標準曲線。

1.7 黃寬條跳甲解毒酶活性測定

黃寬條跳甲羧酸酯酶活性的測定參考Van Asperen 的方法[20]。黃寬條跳甲從田間采回后在實驗室用不同品種油菜至少飼養2周。取黃寬條跳甲成蟲20頭,加入預冷的0.04 mol/L，pH 7.0的磷酸緩沖液1 mL勻漿,勻漿液于4℃,12 000 r/min 離心20 min,取上清液作為酶源備用。根據預試驗結果,用預冷的0.04 mol/L，pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋酶液,向每個試管中依次加入0.9 mL預冷的0.04 mol/L磷酸緩沖液,3.6 mL 3×10-4mol/Lα-乙酸萘酯(含與α-乙酸萘酯1∶1的毒扁豆堿),以及0.1 mL酶液,對照加入緩沖液,30℃水浴振蕩反應30 min,加入1.8 mL顯色劑終止反應。室溫下靜置5 min。于600 nm處測其吸光度,重復3次。用α-萘酚制作標準曲線,計算羧酸酯酶的比活力。

谷胱甘肽S-轉移酶活性測定采用Habig等的方法[21]。每處理取黃寬條跳甲成蟲20頭(來源同羧酸酯酶),加入預冷的0.02 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖液1 mL冰浴勻漿,勻漿液于4℃、12 000 r/min離心15 min,上清液即為酶源。活性測定時依次加入0.2 mL 0.03 mol/L谷胱甘肽,0.2 mL 0.03 mol/L CDNB,2 mL 0.02 mol/L磷酸緩沖液,0.15 mL酶液(對照用緩沖液代替)。立即混勻,340 nm下測定5 min內吸光度變化值,計算谷胱甘肽S-轉移酶的比活力。

1.8 蛋白質含量測定

參照Bradford的考馬斯亮藍G-250法[22]。以牛血清白蛋白制作標準曲線,計算樣品中蛋白質含量。

1.9 數據處理

數據處理均在Excel 2016中計算。試驗結果采用One-way ANOVA with Dunnett’s post test方法進行多重比較,處理與對照之間的差異顯著性采用t測驗,顯著水平設α=0.05。

2 結果與分析

2.1 3個品種油菜幼苗葉片含水量和蠟質含量

‘太空蒙Ⅳ’和‘大黃油菜’葉片含水量顯著高于‘青油14’(表1)。‘大黃油菜’蠟質含量顯著高于其他2個品種,‘太空蒙Ⅳ’和‘青油14’的蠟質含量無顯著差異。

表1 3個春油菜品種葉片含水量和蠟質含量1)Table 1 Water and wax contents in leaves of three spring rape varieties

2.2 3個油菜品種葉片茸毛密度和長度

3個油菜品種葉片正反兩面茸毛密度和長度均有顯著差異(表2)。‘大黃油菜’茸毛密度最大,長度最長;‘青油14’次之,‘太空蒙Ⅳ’最小。

表2 3個春油菜品種葉片正反面茸毛密度和長度Table 2 Pubescence density and length on front and back sides of leaves of three spring rape varieties

2.3 3個油菜品種葉片4種次生代謝物質的含量

3個油菜品種幼苗葉片4種次生代謝物質含量見圖1。3個品種間單寧含量無顯著差異。‘太空蒙Ⅳ’的生物堿含量(59.5 μg/g)顯著高于‘青油14’(56.4 μg/g),而‘大黃油菜’生物堿含量(57.6 μg/g)和‘太空蒙Ⅳ’‘青油14’相比無顯著差異。‘太空蒙Ⅳ’總黃酮含量為0.33 mg/g,‘大黃油菜’總黃酮含量為0.31 mg/g,二者之間沒有顯著差異;‘太空蒙Ⅳ’與‘大黃油菜’的總黃酮含量顯著高于‘青油14’(0.24 mg/g)。3個品種油菜總酚含量與黃酮類似,‘太空蒙Ⅳ’和‘大黃油菜’顯著高于‘青油14’,‘大黃油菜’和‘太空蒙Ⅳ’間無顯著差異。

圖1 3個春油菜品種葉片4種次生代謝物質含量Fig.1 Contents of four secondary metabolites in leaves of three spring rape varieties

2.4 取食不同品種油菜后黃寬條跳甲2種解毒酶活性的差異

圖2表示黃寬條跳甲取食3種油菜后2種解毒酶活性的變化。其中谷胱甘肽S-轉移酶(GST)活性差異很大,3個品種間有極顯著差異(P<0.01),但羧酸酯酶(CarE)活性無顯著差異(P>0.05)。

圖2 取食3個春油菜品種后黃寬條跳甲2種解毒酶活性Fig.2 Activities of two detoxifying enzymes of Phyllotreta humilis feeding on three spring rape varieties

3 結論與討論

植物葉片的形態特征對植食性昆蟲的取食影響很大。葉片上的茸毛可以作為抗蟲因子干擾昆蟲產卵及其對植物的附著和取食,也可以作為保護植物免受外界不利因素干擾的屏障。王艷秋等研究Q型煙粉虱BemisiatabaciQ-biotype對煙草品種的選擇性[23],李德偉等在油茶對茶黃薊馬Scirtothripsdorsalis的抗性研究[24]中均發現植物葉背茸毛密度低的品種抗蟲性較強。植物葉片光滑不利于昆蟲附著為害,相反,昆蟲更容易在葉表茸毛多的品種上附著、取食和產卵。本試驗也發現,不同抗蟲油菜品種,其葉片茸毛密度存在差異,‘太空蒙Ⅳ’抗蟲性最強,其茸毛密度最小。但王麗麗等發現,葡萄葉片茸毛密度和葡萄對綠盲蝽Apolyguslucorum的抗性沒有顯著相關性[25]。綜上所述,植物葉片茸毛密度對植物抗蟲性的影響可能與昆蟲種類、口器、取食部位等有關,不同種類的害蟲,其為害方式和口器不同,都可能導致對植物茸毛密度反應的差異,在抗蟲性研究中應分別對待。另外,植物葉片茸毛長度對其抗蟲性也有一定的影響。常金華等研究高粱對蚜蟲的抗性機制時發現，高感蚜材料表面茸毛密度大但長度短,抗蚜材料‘河農16’茸毛密度小,長度大[5]。本試驗結果表明,‘太空蒙Ⅳ’的正反面茸毛密度和長度都顯著小于其他2個品種,抗蟲性最好。但同為抗蟲品種的‘大黃油菜’無論是茸毛長度還是密度均與‘太空蒙Ⅳ’存在顯著差異,可能是由于‘大黃油菜’屬于芥菜型,而‘太空蒙Ⅳ’‘青油14’屬于甘藍型。不同類型的油菜其茸毛密度和長度不同,推測芥菜型‘大黃油菜’抗蟲性可能與植物表面茸毛沒有特定關系,僅與植物次生代謝物質,防御酶、營養物質等密切相關。

水是植物和昆蟲生存的條件,參與植物及昆蟲體內的各種生理代謝。鄭文靜等研究水稻主要養分對灰飛虱Laodelphaxstriatellus取食選擇性的影響,發現水稻含水量與灰飛虱的選擇負相關[26]。薛俊杰研究發現,水稻對稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis的抗蟲性隨葉片含水量減少而增強,水稻葉片含水量與其抗蟲性具有負相關性[13]。而曾糧斌等在研究苧麻葉片主要化學成分與其抗苧麻夜蛾Cocytodescoerulea的關系時發現,葉片含水量與抗蟲性沒有明顯的相關性[27]。本研究發現,不同品種油菜含水量差異顯著,‘太空蒙Ⅳ’和‘大黃油菜’葉片含水量高抗蟲性強，而‘青油14’葉片含水量低抗蟲性弱，油菜葉片含水量高可能對黃寬條跳甲抗性強，但還需要進一步確定。由于不同品種植物、昆蟲體內含水量不同,植物含水量對抗蟲性的影響可能因植物種類和昆蟲種類而異。油菜在內蒙古西部主要種植在干旱少雨地區,因而油菜葉片含水量高抗逆性相對較強,所以抗蟲性也相對較高。但關于含水量對油菜抗黃寬條跳甲的影響還需要做進一步深入研究。

植物葉片表面的蠟質含量與其抗蟲性緊密相關[28]。 Bodnaryk等研究十字花科植物葉片蠟質與蔬菜黃條跳甲的取食關系,結果表明，葉片具有蠟質層的植物可以更好地抵御蔬菜黃條跳甲的為害[3]。王亓翔等的研究表明,水稻葉片蠟質含量高對稻縱卷葉螟的抗性強[29]。Bergman等認為,蠟質數量的增加會增強紫花苜蓿對苜蓿彩斑蚜Therioaphismaculatus的抗性[30]。本研究結果表明,‘大黃油菜’葉片蠟質含量顯著高于其他兩個品種,與他們的研究結果一致。但抗蟲性更強的‘太空蒙Ⅳ’卻與非抗蟲品種‘青油14’的蠟質含量相近,且無顯著差異,可能是因為‘太空蒙Ⅳ’和‘青油14’都屬于甘藍型油菜,蠟質含量相對芥菜型油菜較低,抗蟲性與其葉片蠟質含量沒有直接關系。很多研究也表明植物葉片蠟質含量與抗蟲性無關[15,31]。植物抗蟲性除與葉片蠟質含量有關外,和蠟質的化學成分、結構等也有關系,而且蠟質可能與其他因素一起對植物抗蟲性起作用。

植物在與害蟲的長期協同進化過程中,為了防御害蟲的侵害,會產生一些對害蟲不利的次生代謝物質。王麗艷等的研究發現,抗蟲水稻品種次生物質含量顯著高于感蟲水稻品種[32]。Demissie等發現酚類物質含量高的玉米品種受麥蛾SitotrogacerealellaOlivier為害程度減輕[33]。單寧是植物產生的最豐富的次生代謝物,其分子結構上的羥基能和其他蛋白質上的羥基結合使昆蟲消化酶活性降低,影響植食性昆蟲對食物的利用。辣椒葉片中單寧含量與辣椒對西花薊馬Frankliniellaoccidentalis的抗性呈正相關[34]。左彤彤等的研究發現,不同地理源的紅松球果和韌皮部的單寧、黃酮和總酚含量不同,3種次生物質含量與其受到球果尺蛾Eupitheciaabietaria和果梢斑螟Dioryctriapryeri的為害率呈現負相關[35]。單寧能與昆蟲唾液蛋白和消化酶結合,降低植物適口性,阻礙昆蟲對寄主植物營養物質的消化和吸收[36]。本研究中,抗蟲品種‘太空蒙Ⅳ’和‘大黃油菜’的總酚和黃酮含量顯著高于感蟲品種‘青油14’,‘太空蒙Ⅳ’總生物堿含量顯著高于感蟲品種‘青油14’。單寧的含量也是‘太空蒙Ⅳ’>‘大黃油菜’>‘青油14’。這些研究結果說明,植物次生代謝物質含量與植物抗蟲性之間有直接的關系,植物次生代謝物質的含量,在一定程度上可以反映植物的抗蟲性水平。

另一方面,植食性昆蟲為分解代謝植物體內的物質和外源有毒物質,形成特有的解毒代謝機制,這是昆蟲與所取食植物長期共同進化的結果。昆蟲通過調節體內解毒酶活性來代謝次生代謝物質,解毒酶活性的變化是昆蟲一種主動的適應機制[37-38]。陳德霞等在研究牧草次生代謝物對亞洲小車蝗Oedaleusasiaticus解毒酶活性影響中發現,取食次生代謝物質(黃酮、生物堿、萜類、酚類和單寧)含量高的牧草,亞洲小車蝗解毒酶活性高,取食次生代謝物質含量低的亞洲小車蝗解毒酶活性也低[12]。牟少飛等研究B型煙粉虱B.tabacibiotype B發現,食物中低劑量的槲皮素會導致煙粉虱CarE和GST的活性顯著升高[39]。本試驗中,黃寬條跳甲取食3個不同品種油菜后2種解毒酶活性有差異。黃寬條跳甲取食‘太空蒙Ⅳ’和‘大黃油菜’2個抗蟲品種后GSTs的活性高于取食‘青油14’,三者間有極顯著差異。黃寬條跳甲取食2個抗蟲品種油菜后CarEs活性比取食感蟲品種油菜的CarEs活性高,但差異不顯著。這一試驗結果可能與不同品種油菜次生代謝物質含量不同有關,抗蟲品種油菜‘太空蒙Ⅳ’和‘大黃油菜’的4種次生代謝物質含量都高于感蟲品種‘青油14’。黃寬條跳甲取食不同含量次生代謝物質的油菜后,通過調節2種解毒酶活性來完成解毒代謝。

油菜是我國最重要的油料作物之一,近幾年主要面臨生產成本高、種植效益低的問題[40],病蟲害的危害加劇也給油菜產業發展帶來一定的不利條件[41]。研究油菜對苗期主要害蟲黃寬條跳甲的抗性機制,減少害蟲為害帶來的損失,同時減少化學農藥的使用,降低生產成本,對未來油菜的綠色可持續發展具有一定的科學指導意義。