云南彌勒甘蔗褐條病病原菌的分離鑒定

李 婕, 李銀煳, 李慶紅, 張榮躍, 王曉燕, 單紅麗, 黃應昆*

(1. 云南省農業科學院甘蔗研究所, 云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室, 開遠 661699; 2. 云南省植保植檢站, 昆明 650034)

甘蔗褐條病(sugarcane brown stripe disease)是我國蔗區常見的重要流行性真菌病害,它影響甘蔗葉片光合作用,從而影響糖分積累,發病嚴重時全株葉片受感染,葉片光合作用嚴重下降,植株矮小,嚴重感病時發病率高達80%以上,一般減產18%～35%,重的可達40%以上,蔗糖分降低15%～30%[1]。該病害于1924年在古巴首次發現[2-3],隨后在美國、中國、印度、澳大利亞、巴西、斐濟、日本、巴拿馬、南非、巴基斯坦、泰國等多個植蔗國家均有不同程度的發生和危害報道,給當地蔗糖產業帶來不同程度經濟損失[4-7]。1975年,海南定安縣甘蔗褐條病暴發流行,重病區發病率達100%,造成甘蔗矮小,減糖減產嚴重[8];1996年至1997年,云南彌勒蔗區大面積種植高感品種‘桂糖11號’,褐條病累計發病面積超過2 000 hm2,損失慘重[9];2001年,廣西蒙山縣褐條病發生流行,危害嚴重[10];2001年,云南臨滄勐甘蔗區發生面積達2 800 hm2[11],2006年、2007年和2009年該病害進一步擴展到鎮康、勐堆、云縣、雙江、耿馬華僑等多個蔗區,最高病株率達100%[12],2009年發生面積達1 284.47 hm2,對當地蔗糖原料安全生產構成了嚴重威脅[13],該病害暴發流行給我國蔗糖產業造成了嚴重經濟損失。

甘蔗褐條病在我國各蔗區普遍發生,已發展成為嚴重影響我國甘蔗產業高質量發展的重要常見病害,弄清其病原種類,有助于抗病品種篩選及病害的有效防控。國內外對甘蔗褐條病研究主要集中在發生情況調查和初步防治研究方面[14-17]。目前,已報道的甘蔗褐條病病原菌多為狹斑平臍蠕孢Bipolarisstenospila(=Helminthosporiumstenospilum)[1, 18]。云南省是我國第二大糖料基地,地處低緯高原,氣候復雜多變。本研究以云南省彌勒甘蔗示范基地褐條病樣為材料,進行病原菌的分離和鑒定,以期為該病害的有效防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

甘蔗褐條病樣品于2019年采自云南省彌勒甘蔗示范基地高感品種‘云瑞10-187’和‘福農11-2907’,采集具有典型癥狀的甘蔗葉各3份,觀察并記錄病害癥狀。

1.2 病原菌分離和培養

采用組織分離法對病原菌進行分離,用滅菌剪刀在病健交界處截取大小約2 mm×2 mm的小塊,依次浸泡于70%乙醇30 s、2%的NaClO 2 min,再用滅菌水沖洗3次,置于滅菌濾紙上晾干,最后置于PDA培養基上28℃恒溫暗培養。3 d后長出白色菌絲,培養7 d后挑取單孢子在PDA培養基上進行純化、保存。

1.3 形態學鑒定

取純化后的菌株接種到PDA培養基中央,于28℃恒溫暗培養7 d后,肉眼觀察菌落形態特征,待其產孢后用解剖針挑取少許菌絲體制片,在顯微鏡下觀察菌絲及分生孢子和孢子梗形態,并測量了50個分生孢子大小。

1.4 致病性測定

供試代表菌株BS1在PDA培養基上28℃生長7 d,然后將純培養的病原菌用滅菌水洗下,倍比稀釋濃度為1.0×106個/mL。接種品種為‘ROC22’,將孢子懸浮液噴于2個月大的健康甘蔗苗葉片上,套袋保濕24 h(相對濕度50%),28～30℃,自然光照。逐日觀察記錄發病情況。以噴滅菌水為對照。每個處理設置3個重復,每個重復1株。待其發病后,對接種發病的甘蔗葉片重新進行病原菌的再次分離及鑒定,觀察其與原接種菌株性狀是否一致。

1.5 病原菌分子生物學鑒定

病原菌總DNA按照真菌基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)說明書提取代表菌株BS1和BS2的基因組DNA。分別用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行ITS序列的PCR擴增[19],引物gpd1(5′-CAACGGCTTCGGTCGCATTG-3′)和gpd2(5′-GCCAAGCAGTTGGTTGTGC-3′)進行GAPDH序列的PCR擴增[20]。25 μL反應體系:ddH2O 8 μL，2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL, 10 μmol/L 上、下游引物各1 μL,DNA模板2.5 μL。ITS和GAPDH基因PCR擴增程序均為:94℃預變性3 min;94℃變性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸45 s,35個循環;72℃延伸10 min。擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,將陽性PCR產物送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。測序結果首先在NCBI進行BLAST檢索,與NCBI上已知序列進行同源比對,然后用MEGA 6.0軟件進行序列分析,采用最大似然法(maximum likelihood)構建系統發育樹,并進行1 000次的Bootstrap檢驗,從而確定其分類地位。

2 結果與分析

2.1 甘蔗褐條病田間癥狀觀察

2019年10月發現云南省彌勒甘蔗示范基地‘云瑞10-187’和‘福農11-2907’高感甘蔗褐條病,發病率為50%～80%。病斑首先出現在幼葉上,最初癥狀為褪綠、橢圓形和水浸狀小斑點,隨著病害的發展,這些斑點沿主脈平行擴展為紅色條紋,隨后變長拉寬呈紅褐色條紋,有些病變周圍有黃色暈圈,成熟的條紋一般長5～25 mm,也可長達50～75 mm,寬2～4 mm(圖1 a)。發病嚴重時,病斑合并連接形成寬帶長條狀紅褐色病斑,最后病葉提早干枯。

圖1 甘蔗褐條病癥狀及病原菌形態Fig.1 Symptoms and pathogenic morphology of sugarcane brown stripe disease

2.2 病原菌分離、培養及形態學鑒定

共分離獲得6個菌株,在PDA上菌落均為圓形,初期呈白色,后逐漸變成灰綠色,菌絲密集(圖1c)。培養7 d后,光學顯微鏡下進行形態學觀察,分生孢子梗淺棕色,有隔,稍彎曲或直,單生或叢生,寬(3.5～5.2) μm,上部彎曲。分生孢子直至稍彎,紡錘形至梭形,淺棕色或棕色,4～10個橫隔,大小為(31.7～96.7) μm×(10.7～16.3) μm,臍不明顯或稍突起(圖1e～1h)。初步將其鑒定為平臍蠕孢屬Bipolaris。

2.3 致病性測定

接種菌株BS1孢子懸浮液3 d后,所有接種植株幼葉出現水浸狀斑點,10 d后這些斑點變為紅褐色條紋(圖1 b),而對照仍無癥狀。從接種蔗葉中再次分離到與接種菌株相同的菌株,但未從對照中分離到。根據柯赫氏法則,進一步確定菌株BS1為甘蔗褐條病病原菌。

2.4 分子生物學鑒定

PCR擴增ITS和GAPDH基因均得到600 bp左右的清晰條帶。代表菌株BS1和BS2測序序列BLAST同源性比對結果顯示,ITS序列(登錄號:MW466590、MW466591)與狗尾草平臍蠕孢Bipolarissetariae模式菌株CBS 141.31(登錄號:EF452444)相似性達99.47%,與菌株CBSHN01(登錄號:GU290228)相似性達100%;GAPDH序列(登錄號:MW473721、MW473722)與狗尾草平臍蠕孢模式菌株CBS 141.31(登錄號:EF513206)相似性達99.83%,與菌株CPC28802(登錄號:MF490833)相似性達100%。基于ITS和GAPDH基因序列構建系統發育樹,發現菌株BS1和BS2與狗尾草平臍蠕孢處于同一分支,親緣關系最近(圖2)。根據形態學和分子生物學鑒定結果將該病原真菌鑒定為狗尾草平臍蠕孢。

圖2 基于ITS(a)和GAPDH(b)基因序列構建菌株BS1和BS2及其相關菌株的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strains BS1 and BS2 and the related strains based on ITS (a) and GAPDH (b) gene sequences

3 討論

平臍蠕孢屬真菌是重要的植物病原菌,可引起多種植物,尤其是禾本科作物及雜草葉斑、葉枯和根腐,造成重大經濟損失,嚴重影響農業生產[20-21]。狹斑平臍蠕孢引起的褐條病是甘蔗葉片上的常見病害,它影響甘蔗葉片光合作用,從而影響糖分積累[1]。

近年來研究發現,甘蔗褐條病病原不止狹斑平臍蠕孢一種,錢雙宏等[17]在海南甘蔗褐條病樣品上分離到菌株HT-4,結合形態及ITS序列將其鑒定為平臍蠕孢屬Bipolaris。Manamgoda等[22-23]和Bhunjun等[24]研究表明ITS、GAPDH和翻譯延長因子1α基因(translation elongation factor 1-alpha,TEF-1α)適合鑒定區分平臍蠕孢屬不同種,其中GAPDH基因為最佳標記,他們結合形態學和這些基因分別對平臍蠕孢屬不同種進行了分子系統發育研究及種的描述鑒定,為甘蔗褐條病病原鑒定奠定了堅實的基礎。目前,僅有Raza等[25]結合形態及分子鑒定,在廣西、廣東甘蔗葉片病斑上發現狗尾草平臍蠕孢。本研究于2019年田間調查發現‘云瑞10-187’和‘福農11-2907’高感褐條病,病株率為50%～80%,結合形態特征、多基因分子鑒定及致病性測定,在云南首次報道了狗尾草平臍蠕孢為甘蔗褐條病病原菌。研究結果豐富了甘蔗褐條病病原菌信息,為后續其他蔗區褐條病的研究奠定了基礎。

多年來田間調查發現,甘蔗褐條病在不同品種不同蔗區發病癥狀略有差異,有的病斑為橘紅色條紋,有的病斑為紅褐色條紋,有些帶有黃色暈圈,有些病斑細小,目前我國尚未對其病原種類及其多樣性進行系統深入研究。狹斑平臍蠕孢和狗尾草平臍蠕孢在形態上的差異主要表現為,狹斑平臍蠕孢分生孢子梗上部偶爾膝曲,通常基部膨脹,分生孢子彎曲、少數直,倒棍狀,3～12個橫隔,臍不明顯[18,25]。而狗尾草平臍蠕孢分生孢子梗基部不膨脹,分生孢子直或稍彎,紡錘形至梭形,4～10個橫隔,臍不明顯或稍突起。國內外研究表明,防治甘蔗褐條病最經濟、安全、有效的方法就是培育和推廣抗病品種[7, 26-28],因此明確甘蔗褐條病病原種類有助于今后篩選抗褐條病甘蔗品種,有助于該病害的科學防控。云南蔗區地處低緯高原,地理位置特殊,地形地貌復雜,甘蔗有害生物種類豐富多樣,在這種復雜的生態環境下,我國甘蔗褐條病病原種類有哪些,優勢種分布、致病力及其變異情況等尚不明確,亟須開展相關基礎研究工作。