云南辣椒正番茄斑萎病毒屬病毒的分子鑒定

桂 敏, 高 雪, 賈志強, 杜 磊, 張芮豪, 胡華冉,鐘秋月, 李永忠, 劉雅婷*, 龍洪進*

(1. 云南農業大學植物保護學院, 昆明 650201; 2. 云南省農業科學院園藝作物研究所, 昆明 650205; 3. 文山學院, 文山 663099)

辣椒CapsicumannuumL.是我國最重要的經濟作物之一,其產值和效益居蔬菜作物之首。云南省是全國辣椒三大主產區之一,據統計,2020年云南辣椒種植面積達17萬hm2左右。近年來,隨著辣椒生產規模擴大、種植區域固定化,辣椒生產上病害逐漸加重,特別是病毒病,嚴重影響了辣椒的產量、品質和經濟效益[1]。世界各地陸續報道的侵染辣椒的病毒病有70種以上,2019年劉勇等報道,我國已達33種[2]。而目前,由正番茄斑萎病毒屬Orthotospovirus病毒侵染辣椒引起的病毒病是世界范圍的重要病毒病害[3]。

正番茄斑萎病毒屬病毒是一類重要的植物病原物,屬于布尼亞病毒目Bunyavirales[4],番茄斑萎病毒科Tospoviridae,正番茄斑萎病毒屬Orthotospovirus。病毒粒子呈球狀,直徑約為80～120 nm;粒體外層由一層脂質包裹,脂質由兩種被稱為糖蛋白(glycoprotein,Gn/Gc)的多糖蛋白組成;脂膜內部為核殼體蛋白(nucleocapsid protein,N)構成的病毒衣殼[5]。N蛋白是正番茄斑萎病毒屬病毒中最保守的蛋白,N蛋白序列相似值是用于鑒定劃分種和血清組的主要依據[6],所以應用核殼體蛋白基因(N-gene)設計引物進行RT-PCR擴增現已成為鑒定該屬病毒的重要方法[7]。2003年我國首次報道正番茄斑萎病毒屬病毒的傳播媒介是薊馬[8-9],主要為西花薊馬Frankliniellaoccidentalis,隨著西花薊馬的發生和流行,正番茄斑萎病毒屬病毒危害范圍逐年擴大,在四川、云南、廣州等地多種園藝植物上發現。該類病毒寄主廣泛,可侵染84個科1 090種植物[10],自然寄主包括番茄[11]、辣椒[12]、煙草[13]、西瓜[14]、萵苣[15]、馬鈴薯[16]、蜘蛛蘭[17]、蝴蝶蘭[18]、鳶尾19]、天竺葵[20]等植物。由其引起的病毒病害每年在世界范圍內對農作物生產造成重大的經濟損失。

正番茄斑萎病毒屬侵染辣椒的癥狀主要表現為:辣椒植株矮化,生長延緩或停滯,發病早的不能結果;葉片和果實會出現褪綠環斑,果實畸形、僵縮,病斑輪紋明顯、黃化或產生壞死環斑、同心圓斑;莖稈上會出現黑斑,植株頂端壞死。

2020年在云南省辣椒主產區硯山縣、廣南縣和會澤縣采集了25份疑似感染正番茄斑萎病毒屬病毒的樣品,本研究對這些病樣進行了癥狀觀察和RT-PCR鑒定,測序并構建系統發育樹,確定了侵染辣椒的正番茄斑萎病毒屬病毒的種類,為云南省正番茄斑萎病毒屬病毒的防控提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年從云南省辣椒主產區硯山縣、廣南縣和會澤縣采集了25份疑似感染正番茄斑萎病毒屬病毒的辣椒樣品(表1)。

表1 疑似感染正番茄斑萎病毒屬病毒的辣椒樣品Table 1 Hot pepper samples with suspected symptoms caused by Orthotospoviruses

1.2 RT-PCR檢測及測序

利用3對正番茄斑萎病毒屬通用引物[21]和6對由課題組設計的N基因特異引物進行PCR檢測[22]。引物信息見表2,按高雪等[23]的方法進行。采用RNA提取試劑盒(北京全式金生物有限公司)提取25個辣椒樣本的總RNA,用PrimeScriptTMⅡ 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)合成cDNA。反應體系為20 μL:cDNA 1 μL,10 μmol/L 上、下游引物各 1 μL,Prime STAR Max DNA Polymerase 10 μL,ddH2O補充至20 μL。PCR反應程序為:98℃ 10 s;98℃ 20 s,57℃ 1～2 min,72℃ 1 min,35個循環;72℃ 10 min;4℃保存。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。對目的條帶割膠純化之后,進行克隆轉化,測序,獲得病毒的N基因序列。

表2 RT-PCR檢測正番茄斑萎病毒屬病毒引物信息Table 2 Primers for detecting Orthotospoviruses by RT-PCR

1.3 構建系統發育樹

測序成功的每一個辣椒分離物的N基因序列與National Center for Biotechnology Information website (NCBI,http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)上已報道的正番茄斑萎病毒屬病毒N基因的同源性進行BLAST比對。將分離的13個N基因序列和從NCBI下載的正番茄斑萎病毒屬的31種病毒的N基因序列進行分析,31種病毒分別是[23]:六出花壞死莖病毒alstroemeria necrotic streak orthotospovirus(ANSV)、豆壞死花斑病毒bean necrotic mosaic orthotospovirus(BeNMV)、辣椒褪綠病毒capsicum chlorosis orthotospovirus(CaCV)、馬蹄蓮褪綠斑病毒calla lily chlorotic spot orthotospovirus(CCSV)、菊花莖壞死病毒chrysanthemum stem necrosis orthotospovirus(CSNV)、花生芽壞死病毒groundnut bud necrosis orthotospovirus(GBNV)、花生環斑病毒groundnut ringspot orthotospovirus(GRSV)、朱頂紅褪綠環斑病毒hippeastrum chlorotic ringspot orthotospovirus(HCRV)、鳳仙花壞死斑病毒impatiens necrotic spot orthotospovirus(INSV)、鶯尾黃斑病毒iris yellow spot orthotospovirus(IYSV)、洋桔梗壞死環斑病毒lisianthus necrotic ringspot orthotospovirus(LNRV)、甜瓜花葉病毒melon severe mosaic orthotospovirus(MSMV)、瓜類黃斑病毒melon yellow spot orthotospovirus(MYSV)、桑脈帶病毒mulberry vein banding orthotospovirus(MVBaV)、花生褪綠扇形斑病毒peanut chlorotic fan-spot orthotospovirus(PCFSV)、辣椒褪綠斑病毒pepper chlorotic spot orthotospovirus(PCSV)、酸漿重型斑駁病毒physalis severe mottle orthotospovirus(PhySMV)、辣椒壞死斑病毒Pepper necrotic spot orthotospovirus(PNSV)、蓼屬環斑病毒polygonum ringspot orthotospovirus(PolRSV)、花生黃斑病毒peanut yellow spot orthotospovirus(PYSV)、大豆莖壞死病毒soybean vein necrosis orthotospovirus(SVNaV)、番茄褪綠斑病毒tomato chlorotic spot orthotospovirus(TCSV)、番茄壞死病毒tomato necrosis orthotospovirus(TNeV)、番茄壞死環斑病毒tomato necrotic ringspot orthotospovirus(TNRV)、番茄壞死斑病毒tomato necrotic spot orthotospovirus(TNSV)、番茄斑萎病毒tomato spotted wilt orthotospovirus (TSWV)、番茄黃斑病毒tomato yellow ring orthotospovirus (TYRV)、番茄環紋斑點病毒tomato zonate spot orthotospovirus(TZSV)、西瓜銀色斑駁病毒watermelon silver mottle orthotospovirus(WSMoV)、西瓜芽壞死病毒watermelon bud necrosis orthotospovirus(WBNV)、小西葫蘆致死褪綠病毒zucchini lethal chlorosis orthotospovirus(ZLCV)。選用MEGA 7.0中的 Clustal W進行多序列比對,通過neighbor-joining法進行系統發育分析,bootstrap為1 000 次。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR鑒定結果

RT-PCR檢測結果顯示(表3～4),25份辣椒樣品中有13份未檢出病毒, 12份樣品檢測出正番茄斑萎病毒屬病毒(部分檢測出病毒的辣椒癥狀見圖1),檢出率為48.0%,其中6份是正番茄斑萎病毒tomato spotted wilt orthotospovirus(TSWV),檢測出率為24.0%;5份是番茄環紋斑點病毒tomato zonate spot orthotospovirus (TZSV),檢出率為20.0%;1份為TSWV和TZSV復合侵染,檢出率為4.0%,這也是在云南辣椒生產上首次發現TSWV和TZSV的復合侵染。

表3 辣椒樣品中正番茄斑萎病毒屬病毒種類分子鑒定結果1)Table 3 Molecular identification results of Orthotospoviruses on hot pepper samples

表4 辣椒樣品中正番茄斑萎病毒屬病毒種類檢出結果Table 4 The results of Orthotospoviruses on hot pepper samples

圖1 部分感染正番茄斑萎病毒屬病毒的辣椒樣品癥狀Fig.1 Symptoms of some hot pepper samples infected by Orthotospoviruses

不同地區采集的辣椒樣品病毒侵染情況略有不同,廣南縣采集的16份樣品中,有10份未檢出病毒,有6份檢測出病毒,其中TSWV檢出2份,檢出率是12.5%,TZSV檢出3份,檢出率是18.8%,TSWV和TZSV復合侵染1份,檢出率是6.3%;硯山縣采集的6份樣品中有5份檢測出病毒,其中TSWV檢出3份,檢出率是50.0%,TZSV檢出2份,檢出率是33.3%;會澤縣采集的3份樣品中,有1份檢測出病毒,為TSWV,檢出率為33.3%。硯山縣和會澤縣都沒有樣品檢測出復合侵染。

2.2 辣椒上正番茄斑萎病毒屬病毒N 基因的進化分析

通過構建系統發育樹,如圖2所示,7份辣椒樣品分離物與云南萵苣的分離物TSWV (JN_664252.1)聚在一同分支,辣椒分離物的N基因序列通過NCBI的BLAST比對,與云南的番茄(MG_656988.1)、旱金蓮(MF_422034.1)、花生(MN_365037.1)、山東的煙草(MN_861984.1)和江蘇的萵苣(KU_976396.1)、北京的桔梗(MF_688996.1)等分離物的TSWV相似;6份辣椒樣品分離物與云南番茄的分離物 TZSV(NC_010489.1)聚在同一分支,與云南蒙自煙草(JN_116578.1)、個舊煙草(JN_116581.1)、鳶尾花(KC_133528.1)、文殊蘭(KP_684519.1)等分離物的TZSV相似;其中1份是TSWV和TZSV兩個病毒復合侵染。由此可見,系統發育樹的分析結果和RT-PCR 的檢測結果相一致。

圖2 正番茄斑萎病毒屬病毒N 基因序列的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on N gene of Orthotospoviruses

3 討論

本研究利用RT-PCR對云南辣椒主產區采集的疑似感染正番茄斑萎病毒屬病毒的辣椒樣品進行分子鑒定,結果顯示,25份辣椒樣品中有12份檢測出該屬病毒,檢出率是48.0%,主要為2種病毒:TSWV和TZSV,2種病毒單獨侵染的檢出率分別是24.0%、20.0%,TSWV和TZSV復合侵染的檢出率是4.0%。劉勇等在2019年對侵染茄科蔬菜作物的病毒種類和分布的研究中發現,正番茄斑萎病毒屬病毒有4種,分別為TSWV、TZSV、WSMoV和CaCV,其中TSWV在云南茄科蔬菜作物的平均檢出率高達17.24%,在云南辣椒上發生最為嚴重,平均檢出率為25.32%[2]。于海龍等[1]在2018年-2019年對我國辣椒主產區辣椒病毒病的調查和鑒定發現,TSWV在辣椒中侵染現象較為普遍,TSWV的檢出率從2018年的6.38%上升到2019年的13.79%,而且這兩年的檢出比例均較高,說明TSWV已是侵染辣椒的優勢種,也是正番茄斑萎病毒屬病毒的重要代表種[24],且具有明顯上升趨勢,存在流行風險,需要嚴加防范。由于實驗室條件有限,只有部分正番茄斑萎病毒屬病毒的引物,13份有癥狀的辣椒材料沒有檢測出含有正番茄斑萎病毒屬病毒,后續應該擴大病毒類型的檢測,明確是否還有其他類型病毒的侵染。

云南具有豐富的氣候類型和傳播媒介的種類,為正番茄斑萎病毒屬病毒的發生、傳播提供了條件,全國調查樣本中共檢出該屬病毒13種,其中云南就有11種,包括番茄斑萎病毒[25]、鳳仙花壞死斑病毒[26]、馬蹄蓮褪綠斑病毒[27]、番茄環紋斑點病毒[28]、花生環斑病毒[16]、辣椒褪綠病毒[29]、辣椒褪綠斑病毒[30]、西瓜銀色斑駁病毒[31]、朱頂紅褪綠環斑病毒[32],桑脈帶病毒[33],辣椒黃斑病毒[34],這些病毒均侵染蔬菜、煙草等經濟作物,對云南省農業生產造成了嚴重危害。

正番茄斑萎病毒屬病毒已從最初發現的四川和云南向國內其他地區快速擴散至遼寧、甘肅、山東等多個地區,侵染多種蔬菜作物,已成為造成我國部分地區辣椒和番茄絕產的主要病毒,尤其是在云南已成為侵染辣椒和番茄的優勢種,所以防控形勢嚴峻。本試驗中有些辣椒樣品疑似感染該屬病毒,但從中未檢測到病毒,可能是生理性病害、藥害或病毒活力較低導致的,也可能為其他種類病毒,還需進一步檢測鑒定。本研究結果僅反映了正番茄斑萎病毒屬病毒病害在云南部分辣椒主產區的發生情況,今后還要擴大辣椒產區進行調查和鑒定,對我省辣椒病毒病的發生和危害起到預警作用,為合理制定云南地區正番茄斑萎病毒屬病毒病害的防治策略提供理論依據。