2株感染蠼螋的球孢白僵菌的分離鑒定及對草地貪夜蛾的毒力

溫紹海, 龐繼鑫, 杜廣祖, 陳 斌, 張立敏

(云南農業大學植物保護學院, 云南生物資源保護與利用國家重點實驗室, 昆明 650201)

蠼螋屬于有翅亞綱Pterygota革翅目Dermaptera,也稱夾板蟲、剪刀蟲等[1]。自然感染蠼螋的昆蟲病原真菌種類較少,已報道有球孢白僵菌Beauveriabassiana感染歐洲球螋Forficulaauricularia和松球螋Forficulasp.[2],神農架被毛孢Hirsutellashennongjiaensis感染未知種蠼螋[3],因而對蠼螋上球孢白僵菌菌株及其毒力的研究報道較為少見。

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(J. E. Smith)是一種嚴重為害玉米等糧食作物的跨境遷飛性害蟲,寄主植物范圍廣,繁殖力強,遷飛擴散快,為害程度重,防控難度大[4]。草地貪夜蛾自2019年1月入侵我國并迅速定殖、蔓延,嚴重威脅我國玉米生產安全[5]。昆蟲病原真菌對草地貪夜蛾具有良好的致病作用,如萊氏綠僵菌Metarhiziumrileyi[6]、玫煙色擬青霉Paecilomycesfumosoroseus[7]、金龜子綠僵菌M.anisopliae和球孢白僵菌Beauveriabassiana[8-9]。然而,不同種類昆蟲病原真菌對草地貪夜蛾的侵染致病作用不同,且在田間自然感染草地貪夜蛾的昆蟲病原真菌還不多見,僅鄭亞強等和雷妍圓等分別從云南和廣東玉米田發現并分離鑒定了感染草地貪夜蛾幼蟲的萊氏綠僵菌[10-11],程東美等在廣州玉米田發現草地貪夜蛾僵蟲并分離獲得了球孢白僵菌[12]。因此,開展昆蟲病原真菌對草地貪夜蛾的毒力測定,篩選高致病力菌株十分必要。

本研究于2020年8月從云南省紅河州元陽縣大果公路和保山市隆陽區蒲縹鎮黃泥村玉米田采集到自然染病的蠼螋,根據蟲體形態特征和地理分布初步鑒定采集自元陽縣的蠼螋為寬翅球螋PterygidaeurypygaBey-Bienko,采集自隆陽區的蠼螋為華球螋ForficulasinicaBey-Bienko。通過形態與分子鑒定病原物為球孢白僵菌,并測定了其基本生物學特性和對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力,旨在為草地貪夜蛾生物防治提供菌種資源,同時也可為該兩株球孢白僵菌的生防潛力研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離培養

將采集到的蠼螋僵蟲,帶回室內用無菌水保濕培養,待產孢后挑取蟲體上的孢子,接于SDAY培養基[13],于溫度(25±1)℃,光周期L∥D=12 h∥12 h,相對濕度(75±5)%的光照培養箱中培養。培養7 d后,將分生孢子轉接到新的培養基上進行純化。經過反復純化,得到純的菌株,純化的菌株采用SDAY 斜面培養基保存于4℃冰箱備用。

1.2 菌株生物學特性

將保存的菌株作為備用菌株,以SDAY培養基作為供試培養基,設置22℃、25℃和28℃ 3種溫度條件(誤差±1℃),RH(75±5)%,光周期L∥D=12 h∥12h條件下的不同光照培養箱中培養。菌落生長速率測定:采用菌液點接法[14-15]接種,配制1×107個/mL的孢子懸浮液,用移液槍吸取5 μL滴于培養基正中間,等待菌液干后封好培養基,在恒溫光照培養箱(RG-300)中培養;采用十字交叉法[16],定期用數顯游標卡尺(ARZ-1331)測量菌落直徑,并記錄其菌落形態和顏色等。產孢量測定:培養15 d后,用直徑為5 mm的打孔器,在培養基平板距離菌落中心位置到邊緣1/2處打孔截取菌塊,重復3次,分別放入含有10 mL 0.05%吐溫-80無菌水的無菌容器中,渦旋振蕩均勻,用微量移液器吸取適量孢子懸浮液滴在血球計數板上,如果顯微鏡視野下孢子數過多,以10倍進行稀釋,至血球計數板上的孢子數可數為止,其中計算產孢量的公式中“80”代表血球計數板上80個正方形小格,靜置30 s后在顯微鏡下觀察和計數孢子數量,統計產孢量[17]。孢子萌發率測定:將菌株孢子配制成1.0×107個/mL的懸浮液,吸取1 mL加入含有10 mL SDAY液體培養基的小錐形瓶中,在搖床中恒溫培養,培養24 h后在顯微鏡下用血球計數板觀察孢子萌發情況,以芽管長度>孢子半徑的孢子計為萌發孢子,觀察n次視野,觀察孢子總數>300個[18-19],計算萌發率。分生孢子大小及分生孢子梗測量:制作臨時玻片在顯微鏡下找到分散的分生孢子和分生孢子梗,用萊卡光學顯微鏡(Leica,750)電腦配套軟件LAS中的圖片處理-距離線測量孢子的大小和孢子梗的長度等。

1.3 菌株的分子鑒定

病原菌在SDAY培養基培養7 d后,取一皿長勢良好的菌刮取菌體,DNA提取使用CTAB法[20]略有改動,65℃恒溫水浴時間由1 h變為30 min,將TE緩沖液換成ddH2O,其他步驟基本相同;采用真菌通用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;PCR反應體系25 μL,ITS1F和ITS4各1 μL,PCR MasterMix 12.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 9.5 μL;PCR反應條件:95℃預變性3 min；94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,35個循環;1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測,在凝膠成像系統下觀察擴增結果。PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 系統發育分析

依據測序得到的結果,將序列進行編輯,去除兩端質量不好的堿基,優化好的序列提交到NCBI網站(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),選擇BLAST進行比對,獲得與目標菌株具有同源性的其他白僵菌菌株的堿基序列,從中下載同源性高的序列,使用MEGA 7.0軟件通過鄰接法(neighbor-joining method,NJ),運行1 000次bootstrap驗證,構建菌株的系統發育樹[21]。

1.5 菌株對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力研究

用0.05% 吐溫-80無菌水沖洗培養基上的白僵菌分生孢子獲得孢子懸浮液,并在搖床(210 r/min)中振蕩30 min混勻,在顯微鏡下用血球計數板配制1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105個/mL和1.0×104個/mL 5個濃度的孢子懸浮液,采用浸漬法[22]接種,用無菌鑷子挑選個體大小基本一致的草地貪夜蛾3齡幼蟲,浸入孢子懸浮液中5 s,然后挑出置于濾紙上吸干菌液,選擇活動性強的個體轉移至已消毒的飼養盒,放入剪好的大小一致的新鮮玉米葉,每一處理20頭,重復3次,對照組(CK)用0.05% 吐溫-80無菌水處理。飼養盒為塑料格子盒(24格,單格尺寸4.2 cm×2.2 cm×3.5 cm),每蟲1格單頭飼養,放入(25±1)℃,RH(75±5)%,光周期L∥D=12 h∥12 h的恒溫培養箱中飼養,每隔24 h更換新鮮的玉米葉和清理糞便,并觀察供試草地貪夜蛾的行為及活動情況、蟲體染菌情況,統計存活和死亡數量[23]。將死亡的蟲體,在滅菌培養皿中于(25±1)℃光照培養箱中保濕培養,每天定時觀察死亡蟲體上菌體的生長和產孢情況,從而確定其為白僵菌感染致死。

1.6 數據處理

根據如下公式分別計算不同處理幼蟲的死亡率、孢子萌發率和產孢量。毒力測定數據采用Probit方法分析,求出毒力回歸方程,計算LC50和LT50,分析與計算均用SPSS 25.0 數據處理軟件完成。

產孢量=孢子總數/80格×400×104×稀釋倍數/打孔器面積(個/cm2)。

2 結果與分析

2.1 菌株分離培養及形態鑒定

YY-1菌株在25℃、SDAY培養基上的生長特性,菌落最外有很小一圈是菌絲生長擴散區域,白色絨毛狀;中間大部分是產孢區域,孢子白色,后期白色稍偏暗粉狀;菌落背面特征和正面相對應,正面凹陷的區域從背面看深入到培養基內部也比較明顯,內圈深褐色,外圈淡黃色或橘色;分生孢子近球形,大小(1.664～2.523)μm×(2.097～3.628)μm,分生孢子梗彎曲,產孢結構端部膨大,分生孢子梗長55～120 μm,直徑2.9～4.0 μm。

HNC-1菌株在25℃、SDAY培養基上,菌落正面顏色先為白色,后期變為淡黃色,在產孢區域有淡黃色透明液滴滲出,正面形態大致分為兩個不同區域,最外圈是白色的菌絲生長擴散區,內部區域是白色稍偏暗的產孢區,孢子粉狀,后期變為橘色;菌落背面大致分為二個區域,光滑無褶皺,外圈橘黃色,內圈黃褐色;分生孢子橢圓形,大小(1.622～3.183)μm×(2.250～4.420)μm,產孢結構二分叉。分生孢子梗長80～160 μm,直徑2.3～3.7 μm。

2.2 菌株的分子鑒定

對菌株的測序結果進行編輯,去除序列兩端質量不好的堿基,將其在NCBI數據庫進行BLAST比對,YY-1菌株與NCBI數據庫中的球孢白僵菌菌株Beauveriabassiana4510(KX901309.1)的親緣關系最近，相似性高達99.43%,HNC-1菌株與NCBI數據庫中的球孢白僵菌菌株BeauveriabassianaBbTDK005(HQ222969.1)的相似性為99.81%,說明該菌株與數據庫中的球孢白僵菌菌株具有高度的相似性,綜合形態特征鑒定和ITS序列相似性分析,將該菌株確定為球孢白僵菌。

2.3 菌株的生物學特性

YY-1和HNC-1菌株在SDAY培養基上25℃的生長產孢情況,菌落生長速率分別為(3.06±0.20)mm/d和(4.57±0.23)mm/d;培養第15天時的產孢量分別為(5.20±1.06)×107個/cm2和(1.83±0.47)×108個/cm2,其孢子振蕩培養24 h后孢子的萌發率分別為(93.33±7.37)%和(87.67±6.43)%(表1);不同的溫度條件下YY-1菌株的生長速率(F=9.824,P<0.05)、產孢量(F=14.425,P<0.05)和孢子萌發率(F=4.123,P<0.05)差異顯著；HNC-1菌株的生長速率(F=27.422,P<0.05)、產孢量(F=28.728,P<0.05)和孢子萌發率(F=19.330,P<0.05)也有顯著差異。試驗結果表明,25℃是比較合適的生長產孢溫度,溫度過高或過低都不利于菌株的生長產孢。

圖1 蠼螋感染癥狀、白僵菌產孢結構和分生孢子的形態特征Fig.1 Field infection symptoms of earwig, sporulation structure and conidia of Beauveria bassiana

表1 球孢白僵菌YY-1和HNC-1在SDAY培養基上的培養特征1)Table 1 Culture characteristics of Beauveria bassiana YY-1 and HNC-1 on SDAY medium

圖2 基于ITS基因序列構建YY-1和HNC-1菌株與其他球孢白僵菌的系統發育樹(NJ 法)Fig.2 Construction of phylogenetic tree of the YY-1 and HNC-1 strain and other related Beauveria bassiana strains based on ITS region sequence by neighbour-joining method

2.4 菌株對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力

YY-1和HNC-1菌株在不同濃度孢子懸浮液下對草地貪夜蛾3齡幼蟲具有不同程度的致死作用,隨著孢子濃度的增加,致死作用逐漸增強,接種孢子懸浮液后最早于第2天開始出現幼蟲死亡。在1.0×108個/mL濃度下,第8天草地貪夜蛾3齡幼蟲累計死亡率達83.3%和63.3%,在此試驗條件下YY-1菌株的毒力效果好于HNC-1菌株(圖3)。

圖3 YY-1(a)和HNC-1(b)菌株對草地貪夜蛾3齡幼蟲的累計死亡率Fig.3 Cumulative mortality of YY-1 (a) and HNC-1 (b) strains to the third instar larvae of Spodoptera frugiperda

球孢白僵菌YY-1和HNC-1菌株對草地貪夜蛾3齡幼蟲的LC50為1.56×105個/mL和2.11×105個/mL(表2)。YY-1和HNC-1菌株對草地貪夜蛾3齡幼蟲的致死時間效應隨其孢子懸浮液濃度的增加,草地貪夜蛾幼蟲的致死中時縮短,當孢子懸浮液濃度從1×108個/mL降低到1×104個/mL,YY-1菌株的致死中時從4.23 d增加至20.23 d;HNC-1菌株的致死中時從6.12 d增加至22.14 d(表3)。可以看出在此試驗條件下,YY-1菌株的效果好于HNC-1菌株。

表2 球孢白僵菌YY-1和HNC-1對草地貪夜蛾3齡幼蟲的毒力Table 2 Toxicity of Beauveria bassiana YY-1 and HNC-1 to the third instar larvae of Spodoptera frugiperda

3 討論

本研究從玉米田間采集到2頭自然罹病的蠼螋成蟲,目前關于革翅目蠼螋的病原物報道較為少見,可能與革翅目身體構造革質堅硬有關,本研究根據外形特征初步鑒定采集自元陽的蠼螋為寬翅球螋,采集自隆陽區的蠼螋為華球螋,但鑒定結果可能存在誤差,因為部分身體形態已被真菌感染難以辨別;從2頭蠼螋蟲體上分離到2株球孢白僵菌YY-1和HNC-1,在SDAY培養基上,25℃下兩株菌的生長產孢好于22℃和28℃,孢子萌發率無明顯差異,最適生長溫度與許多球孢白僵菌菌株相似[24-25]。

球孢白僵菌是一種常見的昆蟲病原真菌,作為一種常規生物殺蟲劑,具有高效、對非靶標生物較安全等特點,已被廣泛應用于農林害蟲的生物防治[26-27]。近年文獻報道了多株球孢白僵菌對草地貪夜蛾幼蟲的毒力,但是毒力效果差別較大,如分離于土壤的bbbj菌株對草地貪夜蛾3齡幼蟲的LC50為3.37×105個/mL,毒力比較高;而另一株bbhn菌株在108個/mL孢子濃度下處理7 d對草地貪夜蛾3齡幼蟲的致死率低于50%[28]。分離自稻黑蝽Scotinopharalurida若蟲的GZSL-1菌株,在孢子濃度1×108個/mL時對草地貪夜蛾3齡幼蟲的累計校正死亡率可達100%[29];而ZJU435菌株對草地貪夜蛾3齡幼蟲接種10 d后的校正死亡率為23.3%,對4齡幼蟲幾乎無殺蟲活性[30];本試驗從蠼螋上分離到的球孢白僵菌YY-1對草地貪夜蛾3齡幼蟲致病力較高,HNC-1菌株致病力一般。此外,本研究中HNC-1菌株雖然生長產孢較YY-1菌株好,但對草地貪夜蛾幼蟲的毒力效果卻低于YY-1菌株,因此還應加強對YY-1菌株培養條件的研究,以期為該菌株開發提供依據。