外源過氧化氫處理對采后荔枝褐變及活性氧代謝的影響

潘家麗，覃子倚，李 靜，Khoo Hock Eng，董新紅

（桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院/廣西電磁化學(xué)功能物質(zhì)重點實驗室，廣西桂林 541004）

0 引言

【研究意義】荔枝（Sonn）是無患子科（Aspindaceae）荔枝屬（）植物，其味道鮮美，含有多種營養(yǎng)成分并具有多種生理功能，深受消費者喜愛（伍志權(quán)等，2017；齊文娥等，2019）。但荔枝是一種典型的非躍變型水果（Zhang et al.，2018），在采后貯藏階段易被病原菌侵染，且采后生理代謝活動依舊旺盛，使果實內(nèi)部的水分和營養(yǎng)物質(zhì)流失（李華彬等，2017），進而導(dǎo)致果實品質(zhì)劣變，不利于荔枝的采后貯存和運輸。因此，積極開發(fā)實用、安全的采后保鮮技術(shù)，對荔枝果實貯藏品質(zhì)、營養(yǎng)價值和商業(yè)價值的保持，以及貨架期延長均具有重要意義。【前人研究進展】目前大多采用涂膜、化學(xué)藥品處理、氣調(diào)貯藏和低溫貯藏等方法對采后荔枝進行保鮮處理（疏秀林等，2012；張長勇等，2013；Bhushan et al.，2015）。Lin等（2011）研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)1%殼聚糖涂膜處理能降低荔枝果實的呼吸作用，減少水分流失，延長貨架期。Liang等（2012）研究表明經(jīng)60 g/L焦亞硫酸鈉浸泡能有效緩解采后荔枝的褐變反應(yīng)，減少腐爛，從而延長果實的貯藏壽命。于茂蘭等（2014）研究表明在高氧氣調(diào)包裝下能延緩荔枝褐變相關(guān)酶活性，但不利于維生素C（Vc）含量的保持。周沫霖等（2016）研究發(fā)現(xiàn)低溫馴化結(jié)合低溫貯藏可使采后荔枝保持鮮紅色澤，維持較高的感官和口感品質(zhì)。自由基衰老學(xué)說認(rèn)為果蔬衰老的過程是活性氧（ROS）代謝與積累的過程（孫麗娜，2008；郭欣等，2020a）。從龍眼（Lin et al.，2014）、皇冠梨（王慶國等，2020）的研究中可知，過量的ROS累積會導(dǎo)致膜脂過氧化，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，促進細(xì)胞衰老。因此，ROS水平是影響采后果實貯藏品質(zhì)的重要因素。過氧化氫（HO）是一種強氧化劑，無色無毒，對環(huán)境友好，在食品行業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛（石晶等，2009；Bauzá et al.，2014）。外源HO處理果實，對果實是一種氧化脅迫，這種氧化脅迫可能會提高果實對其他脅迫，如冷害、高溫、水分脅迫時的抗氧化防護能力（劉揚，2009）。趙習(xí)姮等（2010）研究發(fā)現(xiàn)HO處理可誘導(dǎo)提高櫻桃番茄和芒果的抗氧化酶活性，增加抗冷性，減輕冷藏期間受到的冷害問題；劉佩等（2017）研究表明采后黃冠梨經(jīng)HO預(yù)處理，可抑制多酚氧化酶（PPO）活性和酚類物質(zhì)消耗，從而減少果皮褐變的發(fā)生。【本研究切入點】雖然目前已有外源HO處理采后水果進行保鮮的研究，但尚未見關(guān)于外源HO對荔枝采后褐變及ROS代謝的研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過研究不同濃度HO處理對荔枝各生理指標(biāo)變化的影響，探討外源HO對荔枝采后褐變及ROS代謝的影響，為荔枝采后保鮮提供途徑，以期提高果實的貯藏品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

妃子笑荔枝購自桂林市五里店果蔬批發(fā)市場（當(dāng)天采摘無處理），HO溶液（純度99%）購自上海源葉生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：FSJA03E1小熊粉碎機（小熊電器股份有限公司）、722PC可見光分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）、TU-1950紫外分光光度計（濟南思奇醫(yī)療設(shè)備有限公司）、PHS-3E電導(dǎo)率儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）和NR60CP色差儀（深圳市三恩時科技有限公司）。

1.2 試驗方法

取大小相近、色澤均一、無病蟲害、成熟度相近的荔枝，于常溫下分別用1、5和10 mmol/L的HO溶液浸泡3 min，以清水處理為對照（CK），自然晾干荔枝表皮水分后，用保鮮袋分裝于4 ℃下貯藏，分別于貯藏后0、3、6、9和12 d取樣，進行失重率、褐變指數(shù)和細(xì)胞膜透性等生理指標(biāo)測定；使用液氮速凍粉碎荔枝果皮樣品，用于丙二醛（MDA）含量、內(nèi)源HO含量、超氧陰離子（O）產(chǎn)生速率、PPO活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性等指標(biāo)的測定。所有試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3 測定指標(biāo)及方法

失重率參照王磊明（2018）的方法測定；褐變指數(shù)參照蔣儂輝等（2019）的方法測定；MDA含量參照Liu等（2018）的方法測定；細(xì)胞膜透性參照李靜等（2016）的方法，將切取的果皮圓片于25 ℃浸泡3 h，采用電導(dǎo)率儀（PHS-3E）測定；內(nèi)源HO含量和O產(chǎn)生速率參照曹建康等（2007）的方法測定，提取上清液的離心時間均為30 min；PPO活性參照白國榮（2019）的方法測定；SOD活性參照王照宇（2017）的方法測定，測定管置于4000 lx光照下反應(yīng)20 min。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 25.0進行顯著性分析，以O(shè)rigin 8.5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源H2O2處理對采后荔枝果實失重率的影響

由圖1可知，隨著貯藏時間的推移，采后荔枝果實失重率不斷升高。貯藏6 d后，5 mmol/L外源HO處理的荔枝果實失重率低于其他處理和CK，但差異不顯著（>0.05，下同），1 mmol/L外源HO處理的失重率與CK差異小，而10 mmol/L外源HO處理的荔枝果實失重率高于其他處理和CK，差異也不顯著。貯藏至第12 d時，5 mmol/L外源HO處理荔枝果實的失重率最低，較CK降低14.29%，10 mmol/L外源HO處理荔枝果實的失重率最高，較5 mmol/L處理增加26.56%，說明5 mmol/L外源HO處理能較好地降低采后荔枝果實的失重率，減少荔枝貯藏過程中水分與營養(yǎng)物質(zhì)的損失，而10 mmol/L外源HO處理增加荔枝水分流失，加速果實品質(zhì)下降。

2.2 外源H2O2處理對采后荔枝果皮褐變指數(shù)的影響

如圖2所示，在貯藏期間荔枝果皮的褐變指數(shù)不斷增大。貯藏3~9 d時，1和5 mmol/L外源HO處理能有效抑制果皮褐變，10 mmol/L外源HO處理的果皮褐變指數(shù)一直高于CK和其他處理。貯藏至第12 d時，1和5 mmol/L外源HO處理的荔枝果皮褐變指數(shù)較CK分別降低4.11%和24.66%，而10 mmol/L外源HO處理的果皮褐變指數(shù)最高，較5 mmol/L處理增加60.00%，加劇荔枝果皮的褐變。結(jié)果表明，低濃度的外源HO處理能抑制荔枝果皮褐變，其中5 mmol/L外源HO處理效果最佳，高濃度的外源HO處理則會加劇果皮褐變，加快荔枝衰老。

2.3 外源H2O2處理對采后荔枝果皮MDA含量的影響

由圖3可知，在0~12 d貯藏期間，CK與外源HO處理組的采后荔枝果皮MDA含量均表現(xiàn)出上升—下降—上升的變化趨勢。貯藏至第3 d時，1和5 mmol/L外源HO處理的荔枝果皮MDA含量顯著低于CK和10 mmol/L外源HO處理（<0.05，下同）；貯藏至第6 d時，各外源HO處理的果皮MDA含量均升高，其中5 mmol/L外源HO處理的MDA含量最低，且顯著低于其他處理和CK，較10 mmol/L處理降低35.08%；貯藏6~9 d時，果皮MDA含量下降，各處理和CK之間差異顯著；貯藏至第12 d時，5 mmol/L外源HO處理抑制MDA含量積累的效果最佳，較CK降低44.72%，而10 mmol/L外源HO處理的果皮MDA含量顯著高于CK和其他處理，其中較5 mmol/L處理增加88.73%。說明低濃度的外源HO處理能抑制荔枝果皮MDA 的產(chǎn)生和積累，高濃度（10 mmol/L）的外源HO則提高果皮中MDA含量。

2.4 外源H2O2處理對采后荔枝果皮細(xì)胞膜透性的影響

細(xì)胞膜透性可通過相對電導(dǎo)率高低來反映，相對電導(dǎo)率越高，細(xì)胞膜透性越大，反之亦然。如圖4所示，隨著貯藏時間的延長，不同處理采后荔枝果皮的相對電導(dǎo)率逐漸升高。1 mmol/L外源HO處理的相對電導(dǎo)率在貯藏3~6 d時顯著低于CK和10 mmol/L外源HO處理，貯藏9~12 d時則差異不顯著；5 mmol/L外源HO處理的相對電導(dǎo)率在貯藏3~12 d時顯著低于CK；而10 mmol/L外源HO處理的相對電導(dǎo)率在貯藏3~12 d期間始終保持最高，但與CK無顯著差異。進一步說明低濃度的外源HO處理能改善采后荔枝果皮細(xì)胞膜透性，其中5 mmol/L外源HO處理效果最佳，過高濃度則加劇細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破環(huán)程度。

2.5 外源H2O2處理對采后荔枝果皮內(nèi)源H2O2含量的影響

由圖5可知，采后荔枝果皮在整個貯藏期間，CK與外源HO處理組之間的內(nèi)源HO含量變化雖有所差別，但均呈上升趨勢。貯藏至第3 d時，各處理和CK的荔枝果皮內(nèi)源HO含量差異不顯著；貯藏至第6 d時，10 mmol/L外源HO處理的果皮內(nèi)源HO含量最高，顯著高于1和5 mmol/L外源HO處理；貯藏至第9 d時，10 mmol/L外源HO處理的果皮內(nèi)源HO含量保持最高，1 mmol/L外源HO處理的果皮內(nèi)源HO含量最低，且顯著低于10 mmol/L處理；貯藏至第12 d時，5 mmol/L外源HO處理的果皮內(nèi)源HO含量顯著低于CK和其他處理，其中較CK降低13.75%，而10 mmol/L外源HO處理的果皮內(nèi)源HO含量顯著高于CK和其他處理，較5 mmol/L處理提高31.36%。表明5 mmol/L外源HO處理能有效抑制采后荔枝果皮內(nèi)源HO的產(chǎn)生，減少ROS積累，10 mmol/L外源HO處理則加速ROS累積。

2.6 外源H2O2處理對采后荔枝果皮O2-產(chǎn)生速率的影響

從圖6可看出，在貯藏期間，5 mmol/L外源HO處理的采后荔枝果皮O產(chǎn)生速率一直下降，且顯著低于CK和其他處理（貯藏3 d與CK無顯著差異除外），貯藏至第12 d時，5 mmol/L外源HO處理較CK降低22.63%；而其他處理在0~9 d貯藏期間，O產(chǎn)生速率均有一個先下降后上升的限降，在第9 d達最大值后又逐步下降，但貯藏末期（第12 d時）仍顯著高于5 mmol/L處理，CK、1 mmol/L和10 mmol/L外源HO處理的O產(chǎn)生速率較5 mmol/L處理分別增加29.24%、23.89%和29.65%。從O產(chǎn)生速率可看出，使用適宜濃度外源HO處理采后荔枝可抑制ROS產(chǎn)生，減少ROS應(yīng)激導(dǎo)致的膜脂過氧化，延緩果實衰老進度。

2.7 外源H2O2處理對采后荔枝果皮PPO活性的影響

PPO是引起果蔬酶促褐變的主要酶類，可催化酚類物質(zhì)氧化成醌類化合物，醌類化合物進一步聚合形成褐色或黑色的聚合物從而導(dǎo)致組織褐變。由圖7可知，貯藏期間采后荔枝果皮的PPO活性總體呈先上升后下降的變化趨勢，PPO活性峰值時間均出現(xiàn)在貯藏第3 d，說明PPO在荔枝貯藏前期較活躍。貯藏3~6 d，荔枝果皮PPO 活性開始下降，1 和5 mmol/L外源HO處理的果皮PPO活性明顯低于CK和10 mmol/L處理；貯藏6~9 d，荔枝果皮的PPO活性逐漸上升；9~12 d時，各處理和CK的果皮PPO活性均下降，貯藏至第12 d時，5 mmol/L處理的PPO活性顯著低于其他處理，較CK降低38.72%，而10 mmol/L HO處理的PPO活性顯著高于1和5 mmol/L處理，分別提高61.12%和136.97%，說明低濃度外源HO處理可抑制荔枝果皮的PPO活性，減少荔枝果皮的褐色物質(zhì)生成，而高濃度外源HO處理加劇采后荔枝褐變速度，加速荔枝衰老。

2.8 外源H2O2處理對采后荔枝果皮SOD活性的影響

SOD是生物體內(nèi)的一種抗氧化酶，可作為反映荔枝品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。從圖8可看出，經(jīng)外源HO處理的荔枝果皮SOD活性在貯藏前期（0~3 d）逐漸升高，且在第3 d時達峰值，5 mmol/L外源HO處理的荔枝果皮SOD活性最高，顯著高于其他處理和CK，較CK提高31.39%；貯藏3~6 d，各處理的SOD活性逐漸下降，貯藏至第6 d時，各處理和CK之間差異不顯著；貯藏6~9 d，各處理的SOD活性均下降，5 mmol/L外源HO處理的荔枝果皮SOD活性保持最高；在貯藏末期（第12 d），5 mmol/L處理的SOD活性較CK顯著提高31.41%，而其他處理之間差異不顯著，說明5 mmol/L外源HO處理可提高采后荔枝果皮的SOD活性，從而維持果實較高的抗氧化水平。

3 討論

果實采后品質(zhì)下降與ROS氧化密切相關(guān)，當(dāng)ROS處于正常水平時無害（Czarnocka and karpiński，2018）。但發(fā)生環(huán)境脅迫時，荔枝果皮O和HO的積累量就會增加，細(xì)胞膜透性增大，若過量的ROS無法及時消除，就會損壞生物大分子，促進細(xì)胞衰老，加速荔枝果實的腐敗。細(xì)胞內(nèi)存在ROS清除體系，而SOD作為清除體系中重要保護酶之一，其對氧自由基具有抑制作用，可分解O和HO等活性氧化物，延緩植物衰老（張綠萍等，2012）。本研究結(jié)果表明，在4 ℃貯藏條件下3種濃度的外源HO處理均不同程度提高采后荔枝果皮的SOD活性，但經(jīng)5 mmol/L外源HO處理的果皮SOD活性顯著提高，相比CK，在貯藏至第12 d時，SOD活性提高34.41%，與此同時內(nèi)源HO含量減少13.75%，O產(chǎn)生速率減少22.63%，1 mmol/L處理的內(nèi)源HO含量和O產(chǎn)生速率雖有減少，但效果不如5 mmol/L外源HO處理顯著，而10 mmol/L處理的內(nèi)源HO顯著提高，說明5 mmol/L外源HO處理能有效增強荔枝果皮的自由基清除能力，抑制活性氧化物的產(chǎn)生。該研究結(jié)果與Liu等（2010）使用外源HO處理黃瓜、Li等（2011）使用外源HO處理小麥幼苗的研究結(jié)果相似，在適宜濃度外源HO的作用下，SOD活性與內(nèi)源HO含量和O產(chǎn)生速率呈負(fù)相關(guān)，可提高植物的抗氧化水平，增強植物對其他脅迫的耐受力。

MDA是荔枝果實成熟軟化進程中膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，可作為判斷荔枝果實是否進入衰老階段的指標(biāo)之一。而細(xì)胞膜透性的大小反映出果皮細(xì)胞抗逆性的強弱，是評價果實品質(zhì)的一個重要指標(biāo)（郭欣等，2020b；千春錄等，2020）。本研究發(fā)現(xiàn)，在采后荔枝的貯藏期間，低濃度的外源HO處理可降低荔枝果皮的MDA含量和相對電導(dǎo)率，而經(jīng)5 mmol/L外源HO處理的MDA含量和相對電導(dǎo)率降低效果最顯著，說明經(jīng)5 mmol/L外源HO處理可減輕采后荔枝的膜脂過氧化作用，降低果皮電導(dǎo)率，改善細(xì)胞膜透性，減輕細(xì)胞膜的損害程度，與Chumyam等（2019）利用外源HO處理鮮切番石榴的研究結(jié)果一致。

PPO活性直接影響果皮褐變程度，果實組織中的酚類物質(zhì)會經(jīng)PPO的催化氧化形成醌類物，然后進一步聚合生成褐色物質(zhì)，引起果皮褐變（馬巖松等，2000）。本研究結(jié)果表明，經(jīng)1和5 mmol/L外源HO處理采后荔枝果皮的PPO活性和褐變指數(shù)均低于CK，而10 mmol/L處理均高于CK。貯藏至第12 d時，5 mmol/L處理的PPO活性較CK降低38.72%，褐變指數(shù)降低24.66%，有效減緩了荔枝果皮的褐變速率，保持荔枝良好的外觀和營養(yǎng)品質(zhì)。該研究結(jié)果與Chen 等（2015）使用HO處理甜瓜、林毅雄等（2016）利用外源HO處理采后龍眼的研究結(jié)果相似，原因可能是適宜濃度的外源HO處理有效維持了三磷酸腺苷（ATP）含量，保持線粒體的完整性，抑制ROS代謝及膜脂過氧化的進行，從而延緩果皮褐變。果蔬品質(zhì)的變化可通過失重率的變化反映出來，失重率上升越快說明果蔬品質(zhì)越差。本研究發(fā)現(xiàn)，貯藏至第12 d時，CK和1、5、10 mmol/L外源HO處理的失重率較第9 d分別提高24.69%、21.52%、21.13%和32.39%，說明低濃度的外源HO處理能緩解荔枝失重率的上升速度，減少荔枝水分流失，高濃度的外源HO處理則加快失重率的上升，降低采后荔枝的品質(zhì)。研究結(jié)果對于HO在果蔬保鮮貯藏領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義，生產(chǎn)中可通過將HO與其他成分如KMnO、CaO等復(fù)合配比處理果蔬，延緩果蔬貯藏品質(zhì)的下降。后期還可對外源HO處理采后荔枝轉(zhuǎn)錄組進行測序分析，分析HO是如何對采后荔枝相關(guān)褐變及ROS代謝的基因進行表達，深入研究HO對采后荔枝貯藏品質(zhì)的影響機理。

此外，本研究在測定失重率、MDA含量、相對電導(dǎo)率、O產(chǎn)生速率、PPO活性和SOD活性等指標(biāo)時，由于不同原因?qū)е碌臉?biāo)準(zhǔn)誤差較大。如失重率的測定中標(biāo)準(zhǔn)誤差過大可能是因為選取的采后荔枝雖大小相近，但荔枝存在個體差異性，隨著貯藏時間的延長水分流失速度不一樣而造成；相對電導(dǎo)率測定中部分?jǐn)?shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)誤差過大的原因可能是煮沸過程及補水過程的誤差；SOD活性測定部分?jǐn)?shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)誤差偏大的原因可能是受光不均勻影響了后續(xù)的吸光度測定等。但通過進一步統(tǒng)計，各處理相對標(biāo)準(zhǔn)差均低于20%，屬于合理誤差范圍內(nèi)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采用5 mmol/L外源HO處理采后荔枝，最能減緩荔枝褐變程度和ROS累積，維持細(xì)胞膜的完整性，延緩果實品質(zhì)下降。說明適宜濃度的外源HO處理可調(diào)節(jié)采后荔枝ROS代謝，過量的HO處理則會導(dǎo)致果實的衰老和褐變。