香蕉莖稈汁液發酵產品的功效成分及抗氧化活性分析

覃翠鈉，李志春，2*，何雪梅，2，楊 瑩，2，零東寧，2，孫 健

（1廣西農業科學院農產品加工研究所/廣西香蕉保鮮與加工工程技術研究中心，廣西南寧 530007；2廣西果蔬貯藏與加工新技術重點實驗室，廣西南寧 530007；3廣西農業科學院，廣西南寧 530007）

0 引言

【研究意義】我國是香蕉生產大國，每年都會產生大量的香蕉副產物。據統計，2019年我國香蕉產量116.56萬t，產生香蕉莖稈約4200萬t（王春芳，2020），是一筆巨大的生物質資源。香蕉莖稈水分含量高（徐樹英，2016），體積大，運輸不便，大部分被直接丟棄，造成環境污染和資源浪費。因此，從能源和環境的角度考慮，進行香蕉莖稈功能性產品的開發研究對增加香蕉產業收入及環境保護具有重要意義。【前人研究進展】香蕉莖稈含有豐富的纖維素和半纖維素（韋傳寶和王吉文，2008），提取香蕉纖維可用于制作香蕉布、繩索、食品包裝袋、醫療衛生用品（劉國歡等，2012；胡佳丹，2018）和光學復合材料等（Chávez-Guerrero et al.，2019）。在畜禽養殖方面，目前研究重點在于通過添加復合菌劑、糖蜜、米糠等制成香蕉莖稈青貯飼料，以改善香蕉莖稈的適口性，增加其營養物質，提高消化率（王超，2007；王倩，2013；程宣，2018）。香蕉莖稈含有氮、磷、鉀等營養成分，且其結構為層層壓緊的復瓦狀葉鞘重疊形成的假桿，具有孔隙結構，可應用于堆肥及育苗基質，以提升土壤肥力（李青松等，2009；鄧小墾，2014）。此外，香蕉莖稈還可用于厭氧發酵產沼氣、精煉生產燃料乙醇（Velasquez-Arredondo et al.，2010；de Sil‐va et al.，2020）及壓縮成型燃料等（劉國歡等，2012；de Souza et al.，2013；Bello et al.，2014）。【本研究切入點】香蕉莖稈在纖維提取、飼料化、堆肥化和基質化等方面已有較多應用研究，但香蕉莖稈汁液發酵食品開發的相關研究報道較少。香蕉莖稈壓榨汁液含多酚類化合物（Pothavorn et al.，2010），具有一定清除2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（ABTS·）能力，對牛血清白蛋白果糖模型AGEs也具有一定的抑制作用，可抑制晚期糖基化終末產物（商文婷等，2016）。此外，香蕉莖稈汁液聯合西藥抗菌藥可抑制大腸桿菌（王莉貞等，2017）。因此，基于香蕉莖稈汁液的功效性，利用汁液發酵成酒和乳酸飲料，開發香蕉莖稈汁液發酵產品具有理論可行性。【擬解決的關鍵問題】以香蕉莖稈汁液為原料，添加一定比例的水，分別接種K1和開菲爾菌劑，經發酵制成酒和乳酸飲料，探究其功效成分及抗氧化能力，為香蕉莖稈汁液的發酵產品開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

香蕉莖稈汁液：所用新鮮香蕉莖稈取自廣西農業科學院內，用打漿機打碎榨汁，原料特性分析結果為水分含量97.40%、總固體含量2.60%、粗灰分含量1.40%、脂肪含量0.10%、蛋白質含量0.57%。

發酵菌劑：開菲爾和K1。開菲爾是一種菌群復合體，購自西安惠可欣微生物科技有限公司。K1菌種是釀酒酵母，實驗室自行培養保存。

主要試劑：二苯代苦味酰自由基（DPPH·）購自美國Sigma公司；無水乙醇和氯化亞鐵購自天津市科隆科技有限公司；維生素E購自上海源葉生物科技有限公司；菲洛嗪（Ferrozine）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；碳酸鈉、沒食子酸、鎢酸鈉和鉬酸鈉購自天津市大茂化學試劑廠；羥自由基測定試劑盒、抗超氧陰離子自由基及產生超氧陰離子自由基測試盒、亞硝酸鹽測試盒均購自南京建成科技有限公司。

主要儀器設備：美析UV-1800紫外分光光度計（上海美析儀器有限公司）、TP5002精密電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）、BSA1245分析天平（Sartorlus Group）、HH-S4數顯恒溫水浴鍋（金壇市萬華實驗儀器廠）和TG16-WS高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 試驗原料為香蕉莖稈汁液（G0），添加一定比例的純水，接種菌劑，裝入發酵罐，于室內室溫發酵。采用批量發酵方式，試驗設計如表1所示，共有4組試驗，每組進行3個平行試驗。表1中用量以總固體含量占發酵總質量百分比計算。

根據表1可知，香蕉莖稈汁液的發酵方式有2種，利用開菲爾菌劑發酵所得產品為乳酸飲料，其發酵工藝為：分別取等量的含100%香蕉莖稈汁液和50%香蕉莖稈汁液經巴氏滅菌，調節發酵汁液糖含量為13%，加入5‰開菲爾菌劑，發酵4~5 d，于4 ℃冰箱保存。利用K1菌劑發酵所得產品為酒，其發酵工藝為：分別取等量的含100%香蕉莖稈汁液和50%香蕉莖稈汁液經巴氏滅菌，添加蔗糖136 g/L，加入0.2‰ K1菌劑，發酵7 d左右，于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 功效成分含量測定 多酚含量測定采用Folin酚法（蔣欣梅等，2018）。分別取0.02 mg/mL沒食子酸0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 mL，加入1.0 mL福林酚和3.0 mL 7.5 g/100 mL碳酸鈉，用純水定容至10.0 mL，搖勻，置于黑暗處2 h，采用紫外分光光度計于波長765 nm處測定吸光值。以沒食子酸含量為橫坐標、吸光值為縱坐標進行擬合，得到標準曲線方程=0.2533+0.0367（=0.9990）。結果以沒食子酸當量（mg GAE/g）表示。以試樣代替沒食子酸重復上述步驟可得樣品多酚含量。

單寧含量測定采用Folin酚法（徐陽純等，2021）。取0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mL單寧酸溶液（5 mg/mL）置于盛30.0 mL純水的50 mL容量瓶中，加入2.5 mL鎢酸鈉—鉬酸鈉混合溶液及5.0 mL碳酸鈉溶液，用純水定容，搖勻，靜置30 min，于波長760 nm處測定吸光值。以單寧酸含量為橫坐標、吸光值為縱坐標進行擬合，得到標準曲線方程=0.0988+0.0175（=0.9990）。以試樣代替單寧酸重復上述步驟可得樣品單寧含量。

總黃酮含量測定采用亞硝酸鈉—硝酸鋁—氫氧化鈉法（Jia et al.，1999；王敏等，2022）。用移液槍分別精確吸取0.1 mg/mL蘆丁0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mL，用70%乙醇補至10.0 mL，加入0.8 mL 10%硝酸鋁，搖勻，靜置6 min，再加入10.0 mL 10%氫氧化鈉溶液，用70%乙醇定容至25.0 mL，搖勻放置15 min，于波長510 nm處測定吸光值。以蘆丁含量為橫坐標、吸光值為縱坐標進行擬合，得到標準曲線方程=0.0167+0.0131（=0.9990）。以試樣代替蘆丁重復上述步驟可得樣品總黃酮含量。

1.2.3 抗氧化能力測定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力 采用DPPH自由基清除法（鄭鳳錦等，2015）。吸取試樣于離心管中，用純水補至2.0 mL，加入2.0 mL 6.5×10mol/L DPPH溶液，搖勻，暗處反應30 min，取上清液于波長517 nm處測其吸光值（A）；另取上述試樣于離心管中，加入2.0 mL無水乙醇，搖勻，暗處反應30 min，在波長517 nm 處測其吸光值（A）；2.0 mL 6.5×10mol/L DPPH溶液與2.0 mL無水乙醇反應為參比，其吸光值記為（A）；同時以維生素C（Vc，0.5 mmol/L）為對照。測定3次取平均值，DPPH自由基清除率（）計算公式如下：

1.2.3.2 抑制羥自由基能力 使用試劑盒測定。按照試劑盒指示步驟加入所有試劑，同時以Vc（20 mmol/L）作為對照組，混勻，室溫放置20 min，于波長550 nm處測定各管吸光值。抑制羥自由基能力（U/L）=（對照OD值-測定OD值）/（標準OD值-空白OD值）×標準品濃度（8.824 mmol/L）/取樣量×樣本測試前稀釋倍數×1000。

1.2.3.3 抗超氧陰離子自由基能力 使用試劑盒測定。按照試劑盒指示步驟加入所有試劑，同時以Vc（6.67 mmol/L）作為對照組，混勻，靜置10 min，于波長550 nm處測定各管吸光值。抗超氧陰離子自由基能力（U/L）=（對照OD值-測定OD值）/（對照OD值-標準OD值）×標準品濃度（0.15 mg/mL）×1000×樣本測試前稀釋倍數。

1.2.3.4 金屬螯合率 采用氯化亞鐵溶液與Fer‐rozine顯色法（鄭鳳錦等，2015）。取試樣于離心管中，用純水補至2.0 mL，加入1.0 mL 2.0 mmol/L氯化亞鐵及0.2 mL 0.5 mmol/L Ferrozine試劑，混勻，室溫下靜置反應10 min，于波長562 nm處測定吸光值（A）；用純水替代Ferrozine試劑測得吸光值（A）；空白試驗用純水替代不同體積試樣，測得吸光值（A）。同時以EDTA（2 mmol/L）替代試樣為對照，重復測定3次，金屬離子螯合力率（）計算公式如下：

1.2.4 亞硝酸鹽含量測定 使用試劑盒測定。按照試劑盒指示步驟加入所有試劑，同時以純水作為對照組，混勻，15 min后，0.5 cm光徑比色杯，純水調零，于波長550 nm處測各管OD值。亞硝酸鹽含量（μmol/L）=（測定OD值-空白OD值）/（標準OD值-空白OD值）×標準品濃度（100 μmol/L）×樣本測試前稀釋倍數。

1.3 統計分析

采用Excel 2016處理數據，SPSS 21.0進行差異顯著性分析及主成分分析，以Origin 2018制圖。

2 結果與分析

2.1 香蕉莖稈汁液發酵產品的功效成分測定結果

香蕉莖稈汁液發酵產品的功效成分測定結果如表2所示。不同香蕉莖稈汁液含量的發酵酒和乳酸飲料的多酚及單寧含量均具有顯著差異（<0.05，下同），KF50、KF100、K50和K100的多酚和單寧含量均高于G0的多酚和單寧含量。K100的多酚和單寧含量分別較K50高18.7%和32.2%，KF100的多酚和單寧含量分別較KF50高24.7%和10.3%。此外，KF50和KF100的多酚含量分別較K50和K100低16.3%和12.0%，其單寧含量分別較K50和K100高87.5%和56.4%。從香蕉莖稈汁液及香蕉汁液發酵酒和乳酸飲料中均未檢出總黃酮。

2.2 香蕉莖稈汁液發酵產品的抗氧化能力測定結果

2.2.1 香蕉莖稈汁液發酵產品的DPPH自由基清除能力 香蕉莖稈汁液發酵酒和乳酸飲料的DPPH自由基清除能力測定結果如圖1所示。KF50、K50和K100的DPPH自由基清除能力隨樣品體積增加呈先上升后趨于穩定的變化趨勢；G0的DPPH自由基清除能力整體隨樣品體積增加而增強，但其增強幅度較小，KF100最低；與G0相比，KF50、K50和K100表現出較強的DPPH自由基清除能力。當樣品體積<1.4 mL時，DPPH自由基清除能力的排序為：K100>K50>KF50>Vc>KF100，當樣品體積≥1.4 mL時，K50的DPPH自由基清除能力與Vc無明顯差異。

2.2.2 香蕉莖稈汁液發酵產品的抑制羥自由基能力由圖2可知，香蕉莖稈汁液發酵產品及對照抑制羥自由基能力排序為：G0>Vc>K50>K100>KF50>KF100。其中，香蕉莖稈汁液發酵酒及KF50的抑制羥自由基能力均超過86000 U/L，而KF100的抑制羥自由基能力最低，為69500 U/L。

2.2.3 香蕉莖稈汁液發酵產品的抗超氧陰離子自由基能力 香蕉莖稈汁液發酵產品的抗超氧陰離子自由基能力如圖3所示。K50的抗超氧陰離子自由基能力較強，其值為49.8 U/L，是K100抗超氧陰離子自由基清除能力的4倍；KF50和KF100的抗超氧陰離子自由基能力分別為23.7和18.2 U/L。G0則表現為具有產生超氧陰離子自由基能力。

2.2.4 香蕉莖稈汁液發酵產品的金屬螯合率 如圖4所示，當樣品體積<1.0 mL時，香蕉莖稈汁液發酵產品及對照的金屬螯合率排序為：KF100>G0>K100>KF50>K50>EDTA，當樣品體積≥1.0 mL時，金屬螯合率排序為：KF100>K100>G0>KF50>K50>EDTA。在樣品體積為0.2~0.6 mL時，KF100的金屬螯合率由42.2%升至最大值98.0%，當樣品體積>0.6 mL，其金屬螯合率趨于穩定；而另外3組試驗樣品的金屬螯合率隨樣品體積的增加逐漸增強。K100和KF100的金屬螯合率分別大于K50和KF50的金屬螯合率。

2.3 香蕉莖稈汁液發酵產品抗氧化活性的主成分分析結果

對4個抗氧化活性指標（DPPH自由基清除能力、抑制羥自由基能力、抗超氧陰離子自由基能力和金屬螯合率）進行主成分分析。提取2個主成分（PCA1和PCA2）進行主成分分析，碎石圖見圖5，主成分分析載荷矩陣見表3，方差貢獻率見表4，主成分載荷矩陣見表5。

由圖5可知，特征根在第3個變得平緩，說明可提取2個主成分。由表3可知PCA1、PCA2與4個抗氧化活性指標的相關性。由表4可知，PCA1的特征值和方差貢獻率分別為3.005和75.129%，PCA2的特征值和方差貢獻率分別為0.921和23.029%。2個主成分的累積方差貢獻率為98.158%，即2個主成分共解釋主成分的98.158%，說明提取2個主成分能絕大部分地保留原始信息，主成分分析效果很好。以2個主要成分代表原始4個抗氧化活性指標，根據表5，建立抗氧化活性的評價模型，PCA1表達式如公式（3），PCA2表達式如公式（4）：

以2個主成分的得分及權重建立抗氧化活性指標的綜合評價函數，其表達式如公式（5），得到香蕉莖稈汁液發酵酒和乳酸飲料的抗氧化活性綜合得分及排名（表6）。

由表6可知，K50、KF50和K100得分較高且均為正數，分別排名第1、第2和第3，而KF100得分為負數，排名第4。由分析載荷矩陣（圖6）可知，PCA1主要與DPPH自由基清除能力和抑制羥自由基能力呈正相關，與金屬螯合率呈負相關，PCA2主要與抗超氧陰離子自由基能力呈負相關。PCA1權重較大，根據圖1和圖2，K50的DPPH自由基清除能力和抑制羥自由基能力較高，金屬螯合率低于其他組，因此其得分最高。

2.4 香蕉莖稈汁液發酵產品的亞硝酸鹽含量測定結果

亞硝酸鹽是一種潛在的致癌物質，控制發酵飲品中亞硝酸鹽的含量對于提高食品安全性具有重要意義。如圖7所示，香蕉莖稈汁液發酵酒和乳酸飲料的亞硝酸鹽含量排序結果為：KF100>K100>KF50=K50。KF100的亞硝酸鹽含量最高，達2.3 μmol/L，顯著高于其余3組，其余3組的亞硝酸鹽含量均低于0.5 μmol/L。

3 討論

開菲爾是一種復合菌劑，主要由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌及明串珠菌等多種微生物組成，在發酵過程中產生酸類、酯類、醇類、酮類等物質，從而賦予發酵產品獨特的風味；同時，發酵過程中產生多種生物活性肽，可抑制病原菌（Gamba et al.，2016；Kim et al.，2016）、降低膽固醇（Choi et al.，2017）、改善消化機能（Xing et al.，2017）等，對人體具有促健康作用。K1為釀酒酵母，是白酒生產中酒精發酵的主體菌，其代謝產物為醇類、酯類、醛類、酚類等物質，對白酒的風味及質量具有重要意義。本研究以香蕉莖稈汁液為原料，接種開菲爾菌劑和K1菌劑，經發酵制成酒和乳酸飲料，探究其功效成分和抗氧化能力。

多酚具有潛在的促健康作用，其抗氧化功能可對慢性病起到預防作用（董紅竹，2017）。而單寧具有抗菌抑菌作用，相關研究表明，低濃度的單寧可與細菌的酶和毒性蛋白結合，從而使酶和蛋白失去活性物質（魏麗等，2017）。香蕉莖稈是香蕉產業的重要副產物，汁液中含多酚等化合物，具有較高的抗氧化活性。香蕉莖稈汁液的乳酸發酵飲料和發酵酒功效成分測定結果表明，K100和KF100的多酚與單寧含量分別高于K50和KF50，與試驗設計中香蕉莖稈汁液用量有關，K100和KF100的原料中多酚與單寧含量高于K50和KF50。K50和K100的多酚含量分別顯著高于KF50和KF100，而其單寧含量分別顯著低于KF50和KF100。這可能是因為發酵使用2種不同的菌劑，其對多種構型的多酚轉化影響不同，且不同菌劑發酵代謝產物酚類物質有所差異。經開菲爾和K1菌種發酵的香蕉莖稈汁液的多酚與單寧含量顯著提高，與相關文獻的研究結果一致。如葉盼等（2016）選取植物乳桿菌對蘋果汁進行發酵，研究發現發酵后蘋果汁的多酚含量較發酵前增加52.1%。馬玉蓉等（2021）以小麥和紅提葡萄為原料，研究不同發酵方式對葡萄小麥復合酒品質的影響，發現單一原料發酵50%再混合發酵及浸漬3 d的紅提葡萄醪與糖化48 h的小麥混合發酵2種方式發酵產物的單寧含量增加。王柳岑等（2022）以毛酸漿果汁為原料，接種植物乳桿菌和副干酪乳桿菌混合發酵，結果發現發酵產品的多酚含量增加。多酚含量增加可能是因為發酵過程中，大分子酚類物質被微生物轉化成小分子酚類物質，從結合態轉化為游離態（Chu and Chen，2006；董紅竹，2017；陳樹俊和王婉榕，2021）。單寧含量增加可能是因為隨發酵時間延長，可溶性單寧逐漸釋放（郭敏，2011）。

抗氧化能力研究結果表明，與G0相比，KF50、K50和K100具有更強的DPPH自由基清除能力。在樣品體積為0.2~1.4 mL時，K100的DPPH自由基清除能力最強，K50次之，香蕉莖稈汁液發酵酒的DPPH自由基清除能力強于乳酸發酵飲料。樣品體積<1.4 mL時，DPPH自由基清除能力排序為：K100>K50>KF50>Vc>KF100，當樣品體積≥1.4 mL 時，K100、K50和KF50對DPPH自由基清除能力與Vc相似。說明香蕉莖稈汁液發酵酒和乳酸飲料具有一定的自由基清除能力，與鄭鳳錦等（2015）研究發現甘蔗果酒和甘蔗原醋對DPPH自由基具有一定的清除能力，黃寧馨等（2021）研究發現復合乳酸菌發酵枸杞果汁對DPPH自由基具有清除作用的結果一致。相關研究結果表明，多酚的抗氧化活性成分對DPPH自由基具有一定的清除作用，且多酚含量影響抗氧化活性（Sakanaka and Ishihara，2008；Sah et al.，2014；許立偉等，2021；劉茂等，2022）。G0的抑制羥自由基能力最強，而香蕉莖稈汁液發酵產品中，K50的抑制羥自由基能力顯著強于其余3組，且KF50、K50和K100的抑制羥自由基能力均達86000 U/L以上，說明其對羥自由基具有清除作用。有研究表明，抑制羥自由基能力與多酚含量相關，因酚類與羥自由基結合，使羥自由基清除率變大（張麗，2020；張雪等，2021）。香蕉莖稈汁液發酵產品中，K50的抗超氧陰離子自由基能力最高，G0則表現為具有產生超氧陰離子自由基能力，可能是重要生物分子在有氧存在時氧化產生超氧陰離子自由基（李國婧，2012）。相關研究結果表明，抗超氧陰離子自由基能力與樣品中Vc、黃酮類化合物含量及超氧化物歧化酶活性差異有關（Sasipriya et al.，2014）。具體機理有待進一步研究。

通過金屬螯合可有效清除羥自由基（喬支紅等，2021），從而避免金屬對生物體的危害（鄭鳳錦等，2015）。本研究結果表明，KF100的金屬螯合率最高，K100和KF50分別排第2和第3，K50排第4，而4組樣品的金屬螯合率均高于對照組。說明香蕉莖稈汁液發酵酒和乳酸飲料均具有較高的金屬螯合率。

主成分分析法利用降維的思想，在盡量保留數據原始信息的情況下，把多個指標轉化為少數幾個綜合指標的一種多變量數據進行最佳綜合簡化的多元統計方法。本研究利用主成分分析法對香蕉莖稈汁液發酵產品的抗氧化活性指標進行綜合評價排名，結果顯示，K50綜合排名第1。根據分析過程，本研究主要提取2個主成分進行分析，第一主成分與DPPH自由基清除能力和抑制羥自由基能力呈正相關，與金屬螯合率呈負相關，且第一主成分權重較大（75.129%）。K50的DPPH自由基清除能力和抑制羥自由基較高，金屬螯合率低于其他組，所以其抗氧化活性綜合得分最高。反之，KF100的金屬螯合率顯著高于其他組，所以其得分最低。

亞硝酸鹽具有毒性，人體攝入量達0.3~0.5 g時會引起中毒，而攝入量達3.0 g時會引起死亡。根據GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》，亞硝酸鹽在醬腌菜中含量不超過20 mg/kg。在試樣發酵過程中，微生物代謝活動產生的硝酸還原酶使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，導致硝酸鹽含量增加。4組試驗樣品中，KF100的亞硝酸鹽含量最高，為2.3 μmol/L，以醬腌菜的標準計，其含量并未超出標準范圍。4組樣品中亞硝酸鹽含量存在顯著差異是因為受發酵過程微生物代謝活動的影響，且亞硝酸鹽不穩定，可分解生成N或NH+（陳伊凡等，2020）。

根據本研究結果可知，香蕉莖稈汁液發酵酒和乳酸飲料具有一定的自由基清除能力，可進一步開發成為功能性產品，但其發酵工藝及體內抗氧化活性有待深入研究。

4 結論

香蕉莖稈汁液發酵產品具有一定的自由基清除能力和較高的金屬螯合作用，其中發酵酒K50綜合排名第1，該結果可為進一步開發香蕉莖稈汁液發酵產品提供參考。