斜帶石斑魚(yú)BAG-1基因克隆及表達(dá)分析

李 星，吳子杰，溫依銘，劉結(jié)紅，蔡 佳*，簡(jiǎn)紀(jì)常*

（1廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江 524088；2廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088；3廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088）

0 引言

【研究意義】斜帶石斑魚(yú)（）是我國(guó)南方沿海地區(qū)及東南亞各國(guó)的名貴海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高（王大鵬等，2012；張濤等，2018）。近年來(lái)，隨著斜帶石斑魚(yú)高密度、集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖環(huán)境日趨惡化，斜帶石斑魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中細(xì)菌病和病毒病頻繁發(fā)生，且病原感染能誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞死亡，其形式包括凋亡、自噬和壞死（Georgiadis et al.，2001；Qin et al.，2003，2006；陳大瑋等，2011）。BAG-1是篩選Bcl-2結(jié)合蛋白（Bcl-2-associated athanogene，BAG）時(shí)鑒定獲得的第一個(gè)蛋白，其C端含有BAG結(jié)構(gòu)域，能介導(dǎo)BAG家族蛋白的抗凋亡活性（Doukhanina et al.，2006）。因此，研究基因在斜帶石斑魚(yú)各器官組織中的表達(dá)特征，有助于了解斜帶石斑魚(yú)在病原感染后的免疫防御機(jī)制，為其病害防治提供新的策略。【前人研究進(jìn)展】BAG-1可能參與魚(yú)類(lèi)應(yīng)對(duì)病原入侵的免疫反應(yīng)。細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞程序性死亡的一種主要形式，已被證實(shí)在個(gè)體發(fā)育、損傷修復(fù)及病原清除等過(guò)程中扮演著重要角色（Yu et al.，2015），其過(guò)程主要受Bcl-2家族及相關(guān)蛋白的調(diào)控（Danial and Korsmeyer，2004）。BAG是一類(lèi)抗凋亡蛋白家族，通過(guò)與Bcl-2相互作用而顯著增強(qiáng)Bcl-2的抗凋亡作用，促進(jìn)細(xì)胞存活（Takayama et al.，1995）。BAG-1可通過(guò)與Raf-1絲氨酸/蘇氨酸激酶或Hsc70/Hsp70結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞增殖（Pennell and Lamb，1997；Brive et al.，2001），且有研究證實(shí)外源刺激誘導(dǎo)的Hsp70表達(dá)可與Raf-1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合BAG-1，削弱Raf-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制細(xì)胞增殖（Song et al.，2001）；BAG-1還可作為Hsc70/Hsp70 的核苷酸交換因子（NEF）刺激Hsc70 ATP水解，調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)、凋亡、增生和遷移（Knee et al.，2001；李穎等，2009），并參與蛋白酶體降解途徑與自噬間的切換，調(diào)節(jié)蛋白酶穩(wěn)態(tài)（Minoia et al.，2014；Liu et al.，2020）。BAG-1的中心泛素樣結(jié)構(gòu)域（UBL）與26S蛋白酶體（Knee et al.，2001）可直接相互作用，促進(jìn)蛋白酶體降解靶蛋白，還能與具有E3泛素連接酶活性的CHIP（carboxy ter‐minus of Hsp70 interacting protein）及Hsp70形成三元復(fù)合物降解靶蛋白，同時(shí)BAG-1通過(guò)依賴于CHIP的泛素化參與蛋白酶體調(diào)控，在此過(guò)程中BAG-1的泛素樣結(jié)構(gòu)域區(qū)可增強(qiáng)CHIP靶向蛋白的作用（魏瑞敏等，2016）。此外，人類(lèi)巨細(xì)胞病毒（HCMV）感染胚胎肺細(xì)胞后，基因表達(dá)上調(diào)，而干擾基因表達(dá)能抑制HCMV的抗凋亡活性（Li et al.，2015），說(shuō)明BAG-1在宿主抗病毒感染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用；BAG-1在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于肺臟良性病變組織，對(duì)于細(xì)胞病變也有一定的抑制作用（馬家寶等，2009）。凋亡調(diào)控基因-1蛋白是基因的表達(dá)產(chǎn)物，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)聯(lián)（陳小波和鄭定容，2016）。Kermer等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)基因可顯著降低α突觸核蛋白突變體瞬時(shí)過(guò)表達(dá)對(duì)人類(lèi)神經(jīng)母瘤細(xì)胞產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。【本研究切入點(diǎn)】BAG-1作為抗細(xì)胞凋亡蛋白家族的成員之一，在細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化及應(yīng)激中發(fā)揮重要作用（Hückelhoven，2004；Watanabe and Lam，2006），但目前針對(duì)基因功能的研究主要集中在人類(lèi)和高等脊椎動(dòng)物，關(guān)于魚(yú)類(lèi)細(xì)胞死亡調(diào)控因子在病毒感染中發(fā)揮作用的報(bào)道相對(duì)較少，對(duì)魚(yú)類(lèi)基因的功能也知之甚少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】克隆斜帶石斑魚(yú)基因（）并對(duì)其結(jié)構(gòu)特征、組織表達(dá)分布及在脂多糖（LPS）和聚肌胞苷酸（PolyI:C）刺激后的表達(dá)變化進(jìn)行分析，進(jìn)一步揭示魚(yú)類(lèi)BAG-1在病原感染中的作用機(jī)制，也為了解魚(yú)類(lèi)的抗病免疫提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試斜帶石斑魚(yú)購(gòu)自湛江市東風(fēng)水產(chǎn)市場(chǎng)，試驗(yàn)前1周暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水系統(tǒng)中，活力良好，體表無(wú)傷。LPS和PolyI:C購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Bio.analyzer 2100生物分析儀購(gòu)自美國(guó)Agilent Technologies公司，PrimeSTAR HS DNA高保真聚合酶、Trans-Zol Up Plus RNA Kit、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞及pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 EcBAG-1基因克隆

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選獲得基因EST序列，利用Primer Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物（表1），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 根據(jù)TransZol Up Plus RNA Kit說(shuō)明，分別提取斜帶石斑魚(yú)脾臟、肝臟、胸腺、頭腎、鰓、皮膚、肌肉、大腦、外周血淋巴細(xì)胞和心臟等10種組織的總RNA，使用1.0%凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并以Bio.analyzer 2100生物分析儀檢測(cè)總RNA濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板。

1.2.3基因克隆及載體構(gòu)建 根據(jù)斜帶石斑魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)引物EcBAG-1-F/EcBAG1-R（表1）克隆基因，按PrimeSTAR HS DNA高保真聚合酶說(shuō)明構(gòu)建PCR反應(yīng)體系50.0 μL：5×PrimeSTAR Buffer（MgPlus）10.0 μL，dNTP Mix‐ture 4.0 μL，上、下游引物（2.5 mmol/L）各2.5 μL，cDNA模板2.5 μL，PrimeSTAR HS DNA高保真聚合酶0.5 μL，ddHO 28.0 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃10 s，55 ℃5 s，72 ℃15 s，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；98 ℃10 s，55 ℃5 s，72 ℃5 min，進(jìn)行23個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，目的條帶使用凝膠回收試劑盒純化回收，與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃下倒置恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，菌液PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的克隆送至廣州生工生物科技有限公司測(cè)序。

表1 EcBAG-1基因克隆及實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物序列信息Table 1 Information of primer sequence used in the cloning and real-time fluorescent PCR of EcBAG-1 gene

1.3 生物信息學(xué)分析

利用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找基因開(kāi)放閱讀框（ORF）及其推導(dǎo)氨基酸序列；使用SMART（http://smart.embl-hei‐delberg.de/）獲取基因結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)EcBAG-1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；通過(guò)SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/interactive）分別進(jìn)行EcBAG-1蛋白二、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；采用ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù) 測(cè)EcBAG-1 蛋 白 理論等電點(diǎn)（pI）、分子量及親水性參數(shù)等；在NCBI的Protein BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索與EcBAG-1氨基酸序列相似性較高的BAG-1氨基酸序列，使用ClustalX和MEGA 5.0進(jìn)行多序列比對(duì)，并通過(guò)MEGA 6.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)；運(yùn)用PSORT Prediction（http://psort.hgc.jp/form.html）對(duì)EcBAG-1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析。

1.4 LPS和PolyI:C刺激斜帶石斑魚(yú)

取暫養(yǎng)1周的健康斜帶石斑魚(yú)，采用腹腔注射法分別注射LPS（10 μg/mL）和PolyI:C（1 μg/mL），注射劑量0.1 mL/尾（Wei et al.，2017），對(duì)照組注射等量的PBS。注射0、6、12、24和48 h后分別從各處理組中隨機(jī)采集5尾斜帶石斑魚(yú)的脾臟，提取RAN后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（方法同1.2.2），液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 EcBAG-1基因表達(dá)分析

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)健康斜帶石斑魚(yú)各組織中的基因進(jìn)行檢測(cè)，以EcBAG-1-RT-F和EcBAG-1-RT-R為擴(kuò)增引物，以為內(nèi)參基因（表1）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系10.0 μL：cDNA模板0.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×SYBR Green Mix（Roche）5.0 μL，雙蒸水3.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃5 s，58 ℃15 s，72 ℃20 s，進(jìn)行33個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)5個(gè)復(fù)孔，采用2法換算基因相對(duì)表達(dá)量（Livak and Schmittgen，2001），并以SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EcBAG-1基因ORF序列分析結(jié)果

從斜帶石斑魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得基因EST序列，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序比對(duì)后得到基因ORF序列長(zhǎng)624 bp，共編碼207個(gè)氨基酸殘基（圖1）。EcBAG-1蛋白分子量為49.84 kD，pI為5.18，總平均疏水性為0.866，即EcBAG-1蛋白為疏水性蛋白。據(jù)SMART 4.0預(yù)測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，EcBAG-1蛋白含有1個(gè)典型的家族結(jié)構(gòu)域（BAG）和1個(gè)泛素結(jié)構(gòu)域（UBQ）。TMHMM 2.0跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，EcBAG-1蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域。通過(guò)PSITE對(duì)EcBAG-1蛋白進(jìn)行功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白含有1個(gè)酰胺化位點(diǎn)、2個(gè)異戊二烯基結(jié)合位點(diǎn)、3個(gè)微體C端靶向信號(hào)、4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)N-肉豆蔻酰化位點(diǎn)及1個(gè)真核硫醇蛋白酶組氨酸活性位點(diǎn)。EcBAG-1蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。

圖1 EcBAG-1基因ORF序列及其推導(dǎo)氨基酸序列Fig.1 ORF and amino acid sequence induction of EcBAG-1 gene

圖2 EcBAG-1蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.2 EcBAG-1 protein domain diagram

2.2 EcBAG-1蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

SOPMA預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，EcBAG-1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋（藍(lán)色）占65.22%、延伸鏈（紅色）占10.63%、無(wú)規(guī)則卷曲（紫色）占20.29%、β-轉(zhuǎn)角（綠色）僅占3.86%（圖3）。利用SWISS-MODEL對(duì)EcBAG-1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)該蛋白氨基酸序列與人類(lèi)的BAG-1氨基酸序列具有較高的相似性，故推測(cè)EcBAG-1具有類(lèi)似的生物學(xué)功能。

圖3 EcBAG-1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Secondary structure prediction of EcBAG-1 protein

圖4 人類(lèi)BAG-1蛋白（左）與EcBAG-1蛋白（右）三級(jí)結(jié)構(gòu)的比較Fig.4 Tertiary structure comparison of BAG-1 protein in human（left）and EcBAG-1 protein（right）

2.3 EcBAG-1氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果

使用ClustalX對(duì)EcBAG-1氨基酸序列與大黃魚(yú)（）、斑馬擬麗魚(yú)（）、尼羅羅非魚(yú)（）、牙鲆（）、紅鰭東方鲀（）、紅鮭魚(yú)（）、斑馬魚(yú)（）、熱帶爪蛙（）、人類(lèi)（）等物種的BAG-1氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果（圖5）顯示，EcBAG-1氨基酸序列與大黃魚(yú)的BAG-1氨基酸序列相似性最高（96.62%），與熱帶爪蛙的相似性最低（57.50%）。結(jié)合SMART及NCBI發(fā)現(xiàn)，以上物種氨基酸序列均含有BAG保守結(jié)構(gòu)域，即BAG-1蛋白在以上物種中具有高度保守性。

圖5 EcBAG-1氨基酸序列與其他物種BAG-1氨基酸序列的對(duì)比分析Fig.5 Comparative analysis of amino EcBAG-1 acid sequence with BAG-1 acid sequence in other species

2.4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

基于BAG-1氨基酸序列相似性，通過(guò)MEGA 6.0中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖6）顯示，魚(yú)類(lèi)全部聚為一支，哺乳類(lèi)聚為一支，而原雞和熱帶爪蛙聚為一支。其中，斜帶石斑魚(yú)與大黃魚(yú)（XP_019113087.1）的分類(lèi)地位最近，其BAG-1氨基酸序列相似性達(dá)96.62%；與斑馬擬麗魚(yú)（XP_004542998.1）、尼羅羅非魚(yú)（XP_003438109.1）、牙鲆（XP_0199666 54.1）、紅鰭東方鲀（XP_003975493.1）、紅鮭魚(yú)（XP_029504482.1）、斑馬魚(yú)（NP_001092206.1）的親緣關(guān)系較近，對(duì)應(yīng)的BAG-1氨基酸序列相似性分別為89.86%、89.37%、89.86%、85.89%、82.61%和82.13%；與原雞（NP_001103162.1）和熱帶爪蛙（XP_0029395 43.2）的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，對(duì)應(yīng)的BAG-1氨基酸序列相似性分別為58.45%和57.50%。

圖6 基于BAG-1氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree based on BAG-1 amino acid sequences similarity

2.5 EcBAG-1基因組織表達(dá)分析結(jié)果

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)健康斜帶石斑魚(yú)肝臟、胸腺、脾臟、頭腎、鰓、皮膚、肌肉、大腦、外周血淋巴細(xì)胞及心臟等組織中的基因表達(dá)情況，結(jié)果（圖7）表明，基因在以上組織中均有表達(dá)，且以在大腦中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于在其他組織中的相對(duì)表達(dá)量（<0.05，下同）。

圖7 EcBAG-1基因在斜帶石斑魚(yú)不同組織中的表達(dá)情況Fig.7 Expression of EcBAG-1 gene of E.coioides in different tissues

2.6 EcBAG-1基因在病原感染后的組織表達(dá)特征

經(jīng)LPS和PolyI:C感染刺激后，選取斜帶石斑魚(yú)脾臟組織進(jìn)行進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)分析，結(jié)果（圖8）顯示，2種刺激對(duì)基因在斜帶石斑魚(yú)脾臟中的表達(dá)均具有時(shí)效性。經(jīng)LPS刺激6、24和48 h后，基因相對(duì)表達(dá)量均呈上調(diào)趨勢(shì)，至刺激24 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量達(dá)最大值，但在刺激12 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量略有下調(diào)。經(jīng)PolyI:C刺激6、12、24和48 h后，基因相對(duì)表達(dá)量均呈上調(diào)趨勢(shì)，同樣以刺激24 h時(shí)的上調(diào)幅度最大；與LPS刺激后的基因相對(duì)表達(dá)量相比，PolyI:C 刺激后基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯的下調(diào)趨勢(shì)。可以確定的是，在LPS和PolyI:C刺激24 h后斜帶石斑魚(yú)脾臟中的基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)。

圖8 LPS和PolyI:C刺激后EcBAG-1基因在斜帶石斑魚(yú)脾臟中的表達(dá)情況Fig.8 Expression of EcBAG-1 in spleen of E.coioides after LPS and PolyI:C stimulation

3 討論

本研究從本課題組前期構(gòu)建的斜帶石斑魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（張海艷等，2018）中篩選獲得基因EST序列，利用Primer Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物并成功擴(kuò)增獲得基因。基因共編碼207個(gè)氨基酸殘基，其編碼蛋白含有BAG-1蛋白家族典型的BAG結(jié)構(gòu)域和UBQ結(jié)構(gòu)域，與已報(bào)道的BAG-1蛋白結(jié)構(gòu)相同。通過(guò)BAG結(jié)構(gòu)域，BAG-1能與絲氨酸/蘇氨酸激酶Raf-1或Hsc70/Hsp70競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，BAG-1與Raf-1的結(jié)合可激活Raf-1及其介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；Hsp70與BAG-1的結(jié)合則削弱Raf-1活化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并抑制細(xì)胞生長(zhǎng)（Doong et al.，2002）；UBQ結(jié)構(gòu)域有利于BAG-1連接Hsc70/Hsp70與蛋白酶體，促進(jìn)蛋白酶酶體降解多聚泛素化蛋白（Lüders et al.，2000），最終影響細(xì)胞的應(yīng)激、生長(zhǎng)及凋亡。PSORT Prediction預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，EcBAG-1蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)，故推測(cè)該蛋白具有調(diào)控細(xì)胞死亡與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果也顯示，EcBAG-1氨基酸序列與其他物種的BAG-1氨基酸序列高度相似，說(shuō)明EcBAG-1蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能。在基于BAG-1氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中，斜帶石斑魚(yú)與其他魚(yú)類(lèi)聚為一支，尤其與大黃魚(yú)的親緣關(guān)系最近。

在健康斜帶石斑魚(yú)體內(nèi)，基因在檢測(cè)的各組織均有表達(dá)分布，其中在大腦中的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于在其他組織中的相對(duì)表達(dá)量。哺乳動(dòng)物基因功能研究顯示，基因表達(dá)與創(chuàng)傷性腦損傷相關(guān)（Hayashi et al.，2000；Xu et al.，2012），還能調(diào)控神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖（Elliott and Ginzburg，2009），暗示基因可能具有類(lèi)似的功能。經(jīng)LPS和PolyI:C刺激后，斜帶石斑魚(yú)脾臟中的基因表達(dá)顯著上調(diào)，表明該基因參與斜帶石斑魚(yú)抗病原感染的免疫反應(yīng)。目前，有關(guān)的功能研究主要集中在人類(lèi)和高等脊椎動(dòng)物。由于BAG-1的表達(dá)水平與腫瘤分期及腫瘤細(xì)胞活性關(guān)聯(lián)，因此可作為胃癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的生物標(biāo)志物（Sauerbrei and Haeussler，2018），還可增強(qiáng)增殖和存活的主要調(diào)控因子——核激素受體活性（Ozfiliz et al.，2015）；利用原核表達(dá)獲得的緩殖子特異性蛋白BAG-1建立間接ELISA，可實(shí)現(xiàn)對(duì)弓形蟲(chóng)慢性感染豬進(jìn)行鑒別診斷（熊冰清，2012）。然而，針對(duì)魚(yú)類(lèi)基因的功能尚無(wú)研究報(bào)道。哺乳動(dòng)物的基因研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS刺激后BAG-1與Hsp70的結(jié)合能介導(dǎo)核因子κB（NF-κB）p56亞單位的降解，從而抑制細(xì)菌感染引起的炎癥反應(yīng)（Tanaka et al.，2014）；在人類(lèi)巨細(xì)胞病毒感染后基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而抑制該病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（Li et al.，2015）；在衣原體的感染中基因也具有相似作用（Du et al.，2013）。基因過(guò)表達(dá)還能激活人類(lèi)多瘤性病毒JC病毒（Human polyomavirus JC virus）早期基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性（Devireddy et al.，2000）。然而，近期有研究表明鋸緣青蟹基因沉默能抑制對(duì)蝦白斑病毒（White spot syndrome virus）的增殖及促進(jìn)病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（Ma et al.，2019），說(shuō)明基因可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞死亡而參與宿主的抗病原感染免疫反應(yīng)，因此推測(cè)基因也是通過(guò)類(lèi)似的方式發(fā)揮作用，但具體原理有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

EcBAG-1 蛋白含有BAG-1 蛋白家族典型的BAG結(jié)構(gòu)域和UBQ結(jié)構(gòu)域，具有與哺乳動(dòng)物BAG-1相似的生物學(xué)功能，即基因在斜帶石斑魚(yú)抵御細(xì)菌/病毒感染的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為深入了解魚(yú)類(lèi)的抗感染機(jī)理拓寬了思路。