瀘州真龍柚柚花揮發油化學成分分析

何 然，于小涵，張玉林，王羽哲，蘇 敏，陳斯瑋

（西南醫科大學 藥學院，四川瀘州 646000）

真龍柚柚花（Pummelo Flower），蕓香科植物真龍柚（Citrus grandis(L.) Osbecd）的花或花蕾，主要種植于瀘州市合江縣。合江縣地處長江、赤水河及高洞河流域，有河谷沖積地、深丘、低山地貌，海拔250 ～600 m，形成了獨特的河谷氣候環境，適宜柚類種植[1]。真龍柚早在2012 年就被實施了農產品地理標志登記保護，地理標志保護的區域范圍為合江縣所轄合江鎮、福寶、先市、白沙及密溪等27 個鄉鎮216 個行政村[2]。就真龍柚的生產管理而言，疏花保果尤為重要，但在此過程中，大量的柚花被丟棄，柚花資源利用度極低。可見，真龍柚柚花不但來源廣泛，且有巨大的開發利用空間[3]。

柚花史載于《本草綱目》，味辛、苦，性溫，具有行氣、除痰、止痛的功效，可用于治療胃脘胸膈脹痛[4]。柚花中目前已報道的藥用化學成分主要包括揮發油、黃酮類和其他類成分[5]。揮發油是柚花的3 大有效成分之一，提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、有機溶劑提取法、微波法，以及新興的超臨界CO2萃取法和亞臨界水萃取法等[6]，其中水蒸氣蒸餾法因其操作簡單，成本較低，是最為常用的方法。水蒸氣蒸餾法提取原理是水蒸氣將揮發性物質一并帶出，得到的是具有揮發性的成分，是柚花中獨特香氣的主要產生原因。

本次實驗采收瀘州市合江縣真龍柚的新鮮柚花為實驗材料，通過篩選、處理選出優質新鮮的花簇，選用水蒸氣蒸餾法獲取柚花揮發油進行氣相色譜-質譜聯用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）成分分析，以此來檢測所提取的真龍柚柚花揮發油的組成成分及含量，為后續真龍柚柚花相關實驗研究以及醫學價值的開發利用提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：新鮮真龍柚柚花，四川省瀘州市合江縣密溪鄉，于2021 年4 月采收的新鮮花朵；蒸餾水，實驗室制備；氯化鈉（分析純），成都科龍化工試劑廠。

儀器：Christ Alpa 1-4 LSCbasic 凍干機，北京博釐行儀器有限公司；ME204E/02 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；水蒸氣蒸餾裝置；GCMS-QP2010 Plus 氣相色譜-質譜聯用儀，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

（1）材料凈制。除去泥沙、雜質及蟲蛀霉變品，挑揀出完好新鮮的柚花，然后將柚花分成花蕾和花朵兩部分，柚花花蕾去莖，花朵去莖、柱頭和花蕊多余部分。

（2）凍干處理。用冷凍干燥機冷凍處理柚花48 h，制成柚花凍干，取出，存放至-80 ℃恒溫冰箱中冷藏備用。

（3）水蒸氣蒸餾法。稱取118 g 的柚花凍干，稱定重量（準確至0.01 g），置燒瓶中，以16 ∶1 的液料比，在3.51%的鹽水中浸泡30 min。連接冷凝管與揮發油測定器，自冷凝管上管口加水至揮發油測定器刻度線至有水溢出進入蒸餾燒瓶為止，放入電熱套，微沸約6 h 后，觀察測定器中精油量至不再增加，停止加熱[12]。冷卻片刻，放出下層水，用EP管收集上層黃綠色柚花精油[12]。將得到的粗提品放入-18 ℃恒溫冰箱，待水凝固，用移液槍將上層柚花精油取出。多次重復上述實驗，將多次提取得到的精油合并后存入-4 ℃恒溫冰箱冷藏備用[13]。

1.2.2 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：DB-5MS 氣相毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：柱箱溫度50 ℃，進樣溫度290 ℃，起始溫度50 ℃，保持5 min，以10 ℃/min 升溫至120 ℃，再以5 ℃/min升溫至290 ℃，保持10 min；柱流量1.00 mL/min，總流量9.0 mL/min；進樣量1.00 μL；分流比3.0。

二是檢測+數據：推進監管升級。一要在總結已有數據化監管經驗基礎上，建立大數據監管機制，進一步提升數據化管理效率。二要總結推行政府購買服務的經驗，探索檢測工作，創新培育多元化主體，將適合由專業化社會組織承擔的檢測數據分析業務或服務納入政府購買服務范圍，提高工作效能。

（2）質譜條件。電子轟擊（EI）離子源；離子源溫度200 ℃；接口溫度220 ℃；溶劑延遲時間2.5min；質量掃描范圍33 ～500（m/z）。

2 結果與分析

通過對水蒸氣蒸餾法提取所得真龍柚柚花揮發油按上述GC-MS 條件進行分析，獲得真龍柚柚花揮發油總離子流色譜圖（圖1）。由圖1 可知，檢測得到49 個峰。通過NIST08.LIB 質譜庫檢索，結合相關文獻，從揮發油中分析鑒定出40 種化學成分，并采用面積歸一化法分析統計各成分的相對含量，結果見表1。

圖1 真龍柚柚花揮發油總離子流氣相色譜圖

由表1 分析可知，從水蒸氣蒸餾法提取所得真龍柚柚花揮發油中共分離鑒定出40 種化合物，以醇、烯、醛及酯為主，另有少量烷、苯、酮、酸類化合物。根據平均相對含量，其中相對含量最高的4 種化合物為金合歡醇（18.37%）、反式-橙花叔醇（14.92%）、(S)-1-甲基-4-(5-甲基-1-亞甲基-4-己烯基)環己烯（10.06%）、芳樟醇（8.77%），占比超過50%，為真龍柚柚花揮發油的最主要成分。

表1 真龍柚柚花揮發油主要成分分析

2.1 醇類化合物

真龍柚柚花揮發油中醇類化合物含量最高，占比為53.38%，共有10 種。其中分離鑒定出的金合歡醇（18.37%）和反式-橙花叔醇（14.92%）都是具有特殊花香的物質，橙花叔醇更是具有類似橙花的香氣，所以被廣泛應用在香精香料中。其中含量最高的金合歡醇具有多方面的利用價值。在農藥方面，金合歡醇被作為保幼激素的一種成分，用于制殺蟲劑，金合歡醇和煙堿復配還具有顯著的殺蚜增效作用；在醫藥方面，金合歡醇可用于精神抑制藥和皮膚保護的外用藥物，金合歡醇的酯類衍生物還具有一定的抗癌和抗病毒功效；在化妝品方面，金合歡醇能有效抑制痤瘡的形成，改善肌膚膚質，并可消除體臭和汗臭；殺毒抑菌方面，金合歡醇能夠顯著抑制細菌生物膜的合成，對金黃色葡萄球菌[7]、念球菌、巴西副球孢子菌、禾谷鐮刀菌和新型隱球菌起到良好的殺菌作用；此外，金合歡醇還是某些殺菌材料的強化劑[14-16]。以反式-橙花叔醇為主要成分的降香油具有抗血栓形成的作用[17]。

相關研究表明，揮發油中分離鑒定出的芳樟醇（8.77%）、香葉醇（2.14%）、橙花醇（2.09%）、氧化芳樟醇（1.86%）、香葉基香葉醇（2.58%）及α-紅沒藥醇（1.12%）均具有藥理活性。芳樟醇具有鎮痛、抗焦慮、鎮靜催眠、抗炎、抗腫瘤和抗菌等諸多藥理活性，對大腸桿菌具有非常顯著的抑制作用，具備臨床治療用藥的潛能[18-19]。香葉醇能夠抑制胰腺癌細胞BXPC-3的增值并誘導其凋亡，還可通過調控多種信號轉導通路，發揮抗炎、抑制細胞氧化應激反應、改善糖脂代謝異常、減少細胞凋亡以及改善血管內皮功能障礙等[20-21]。此外，香葉醇在神經保護和消化道潰瘍的治療方面均有一定醫用價值[22]。橙花醇目前被報道的功能主要包括鎮靜舒緩、免疫調節以及抗微生物和防蟲等[23]。氧化芳樟醇在香精香料方面應用已經相當成熟，醫學方面還具有抵消焦慮、抗驚厥的作用[24]。香葉基香葉醇可改善雙膦酸鹽相關性頜骨壞死的發生與發展[25]。α-紅沒藥醇被發現具有多種生物學活性，如可提高細菌對抗生素和抗微生物制劑的抗性、去黑色素及抗癌活性等[26]。反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化-2-呋喃甲醇（1.30%）和6,9-碳十五二烯醇（0.23%）目前研究較少，有待開發。

2.2 烯類化合物

本真龍柚柚花揮發油中鑒定出的16 種烯類化合物中，含量占比在5%以上的有2 種，分別為(S)-1-甲基-4-(5-甲基-1-亞甲基-4-己烯基)環己烯和(+)-檸檬烯。其中檸檬烯具有抑菌、抗腫瘤、止咳平喘、鎮靜、利膽溶石和促進消化等多種生理活性[27]。此外，檸檬烯還可作為多種具有重要應用價值的單萜類衍生物如紫蘇醇、松油醇等的前體物[28]。(S)-1-甲基-4-(5-甲基-1-亞甲基-4-己烯基)環己烯具有抗癢、消炎功能和抗癌功效。此外，紅沒藥烯也是多種高附加值保健品及藥品合成的前體物質[29]。

其次為占比3.38%的α-法尼烯，α-法尼烯是多種中草藥中的重要有效成分，多項研究表明其具有抗氧化和抗炎活性[30]。已有研究表明，姜黃揮發油中的倍半萜類物質具有良好的抗感染、抗氧化功效，其中倍半萜類物質主要為α-法尼烯[31]。

另外，本真龍柚柚花揮發油中還鑒定出了羅勒烯、月桂烯、β-石竹烯、γ-欖香烯、蒎烯和2-蒎烯，此6 種物質已被證明具有較明確的生物活性。相關研究證實，羅勒烯作為一種無環單萜類化合物，具有多種生理作用，如祛痰、鎮咳、抗真菌以及抑制腫瘤等[32]；月桂烯可用于腎臟炎癥的治療[33]；石竹烯的主要功效有抗焦慮、抗抑郁、局部麻醉、鎮痛鎮靜以及保護神經等[34]；欖香烯對多種癌腫細胞均有抑殺作用，整理文獻可見，欖香烯對食管癌、肝癌、肺癌以及骨轉移癌等均有確切療效，并且能夠拮抗化療所引起的免疫功能低下，因而可單獨或聯合用于化療及癌性胸腹水的治療中[35-36]；蒎烯對白色念珠菌具有明顯的抑菌和殺菌作用[37]。

2.3 其他成分

本真龍柚柚花揮發油中鑒定出的物質中，除上述含量較多的醇類和烯類，還包括苯、酸、烷、醛、酯以及酮類化合物共14 種，其中檸檬醛（0.42%）和棕櫚酸甲酯（0.47%）具有較多的藥理價值。已證明，檸檬醛具有多種醫藥價值，包括抗炎[38]、抗癌[39-40]和抑菌[41]活性。在抗炎方面，檸檬醛具有一定的體外抗MRSA 活性，與阿莫西林、頭孢氨芐和頭孢吡肟等β-內酰胺類抗生素聯合使用時可增強β-內酰胺類抗生素的活性[42]。在抗癌方面，檸檬醛作為滲透增強劑廣泛應用于經皮吸收藥物的輔助用藥且具有抗腫瘤活性[43]。在抑菌方面，檸檬醛對中藥材黃曲霉菌有良好抑制作用[41]。同時，棕櫚酸甲酯也被證實具有抑菌活性[44]，以及降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集及血栓形成等作用[45-48]。鄰-異丙基苯（0.11%）、反,反-西基乙酸（0.58%）、分析純正二十烷（0.69%）、氨茴酸甲酯（1.49%）均為具有特殊香氣的物質，被廣泛應用在香精香料中。1-乙烯基-1-甲基-4-丙-2-亞基-2-丙-1-烯-2-基環己烷（0.17%）、(9Z)-十八碳-9,17-二烯醛（0.65%）、香葉酸甲酯（0.20%）、乙酸松油酯（1.72%）、法尼基丙酮（0.50%），目前對其藥理活性尚未有明確研究結果。

3 結論

根據上述真龍柚柚花揮發油成分分析以及柚花精油主要成分抑菌活性的已有研究，主要化學成分中的金合歡醇、芳樟醇和檸檬烯等均具有抑菌作用多種生理活性，由此推測真龍柚柚花揮發油亦具有一定的藥理活性，但目前相關研究仍較少，其具體抑菌效果仍不甚明確，有待進一步研究探索。化學成分分析結果數據可為后續真龍柚柚花相關實驗研究及醫學價值的開發利用提供一定的理論依據。