檸檬酸對機體生長及消化功能影響的研究

袁 夢 黃慧清 陳 瀾 朱錦平 馬燕梅

(福建農林大學動物科學學院（蜂學學院） 福州 350002)

2020 年7 月1 日飼料抗生素全面禁用以來，天然飼料添加劑得到了廣泛關注。酸化劑作為高效、無殘留、無副作用的添加劑，在促進動物生長方面有著較為顯著的作用，是一種常見的飼料添加劑。酸化劑種類很多，主要分為單一酸化劑（無機酸化劑與有機酸化劑）和復合酸化劑兩種。 隨著養殖業的發展，有機酸添加劑在畜禽生產上的應用越來越廣泛， 其中檸檬酸的應用較為普遍。 檸檬酸可以掩蓋飼料中因添加礦物質、維生素等引發的不良氣味，起到調節飼料風味的作用，從而改善日糧的適口性。 周夢佳等[1]研究表明，有機酸可以提升腸道消化吸收能力，為腸道提供適宜的酸度， 使無活性的胃蛋白酶原轉化為有活性的胃蛋白酶，有利于營養物質的消化吸收。酸化劑可以提高動物的生產性能。 劉新澤等[2]報道復合酸化劑可以顯著提高血清免疫球蛋白含量， 從而提高動物機體免疫力，進一步改善生產性能。有機酸還可以改善腸道微生態， 攝入有機酸后偏酸性的微環境對大腸桿菌等病原菌的生長繁殖起到了抑制作用，為胃腸道提供健康的環境。 研究表明，酸化劑對標準大腸桿菌、標準金黃色葡萄球菌、標準沙門氏菌及臨床分離大腸桿菌均具有不同程度的抑菌作用[3]。曾子悠等[4]報道飼糧添加植物精油和酸化劑組合可以提高麻黃肉雞生長性能，改善免疫器官指數、空腸形態和肉品質。 沈一茹等[5]試驗表明飼糧中添加酸化劑可以顯著提高腸道絨毛隱窩比及杯狀細胞數量， 進一步改善肉雞生長性能和腸道發育。 本研究通過體外抑菌試驗和消化道平滑肌收縮試驗， 并給小鼠飼喂不同濃度的檸檬酸溶液， 探究檸檬酸促進機體生長及提高機體消化功能的機制， 為飼料酸化劑的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 6~8 周齡SPF 級C57BL/6 小鼠和2.0±0.02 kg 普通家兔，均購自閩侯縣吳氏實驗動物貿易有限公司。

1.2 主要試劑 胃蛋白酶測定試劑盒 （比色法）和胰蛋白酶測定試劑盒（比色法）購自南京建成生物工程 研 究 所；TRYPTONE、YEAST EXTRACT、Agar 購自OXOID 公司；頭孢噻肟、強力霉素、多粘菌素B、青霉素、 阿莫西林藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 檸檬酸抑菌試驗 試驗設置1 個對照組和2 個試驗組，均使用固體LB 瓊脂培養基。 對照組使用商品化頭孢噻肟、強力霉素、多粘菌素B、青霉素、阿莫西林藥敏片， 試驗組1 接種大腸桿菌標準株（ATCC 25922）， 試 驗 組2 接 種 葡 萄 球 菌 標 準 株（ATCC 25923）， 各試驗組使用不同檸檬酸濃度（0%、1%、5%、10%和15%）的自制試紙片，測量并比較檸檬酸抑菌圈和五種常用抗生素抑菌圈的直徑。

1.4 離體腸道平滑肌收縮試驗 試驗前將小鼠和兔禁食數小時后處死并立即剖開腹腔， 找到胃幽門和十二指腸交界處，以此為起點取長20~30 cm 的腸管，迅速將標本放入臺氏液中，并用臺氏液沖洗腸腔內容物。 沖洗干凈后，將腸管剪成數段，每段長2~3 cm，置于臺氏液中備用。 使用BL-420E+生物機能實驗系統測定不同濃度檸檬酸對離體腸道平滑肌的收縮頻率（次/min）和收縮強度，計算腸管的腸道活動力（腸道活動力=平均強度×頻率， 單位：g·次數/min）。

1.5 檸檬酸對小鼠生長與消化功能的影響 選擇20 只體重相近的6 周齡SPF 級C57BL/6 小鼠飼養于EVC 鼠籠，分為5 組：對照組和4 組試驗組，每組4 只小鼠，對照組正常飲水，試驗組分別飼喂檸檬酸濃度為0.05 g/L、0.1 g/L、0.15 g/L 和0.2 g/L 的飲用水。 飼養周期14 d，每3 d 稱量小鼠體重，以飼養天數為橫坐標、 體重差值為縱坐標繪制小鼠體重生長曲線。

第14 d， 采用摘除眼球采血法采集小鼠全血1 mL， 在37 ℃溫箱靜置30 min 后8 000×g 常溫離心5 min，取血清。 處死小鼠并立即剖取胃、小腸，并分別收集內容物至滅菌EP 管。 按照胃蛋白酶和胰蛋白酶測定試劑盒說明進行操作，分別檢測血清、胃內容物和小腸內容物消化酶活性。

剖14 d 小鼠， 取1 cm 空腸用1×PBS 沖洗后用固定液固定24 h，將固定好的腸管組織送至武漢塞維爾公司委托其制作HE 組織切片并掃描。 運用CaseViewer 軟件測量每個樣本的絨毛長度和隱窩深度并計算絨毛與隱窩的比值。

2 結果與分析

2.1 檸檬酸抑菌圈試驗結果 由表1-表2 可知，檸檬酸對大腸桿菌和葡萄球菌均有抑制作用， 隨著檸檬酸濃度增加，其抑菌效果也遞加。 對于大腸桿菌，10%檸檬酸的抑菌效果與阿莫西林抑菌效果相似，15%檸檬酸的抑菌效果與頭孢噻肟相似。 對于葡萄球菌，10%檸檬酸抑菌效果與多西環素抑菌效果相似，15%檸檬酸的抑菌效果與阿莫西林相似。

表1 檸檬酸對大腸桿菌的抑制作用

表2 檸檬酸對葡萄球菌的抑制作用

2.2 平滑肌收縮試驗結果 在離體腸道平滑肌收縮試驗中，由圖1、圖2 可知，檸檬酸濃度為0.1 g/L和0.15 g/L 時， 隨著檸檬酸濃度升高鼠腸道活動力越高， 當檸檬酸濃度達到0.1 g/L 和0.15 g/L 時，鼠腸道活動力極顯著提高（P＜0.01）。 由圖3、圖4 可知，檸檬酸濃度為0.1 g/L 和0.15 g/L 時，隨著檸檬酸濃度升高兔腸道活動力越高， 當檸檬酸濃度達到0.1 g/L 和0.15 g/L 時， 兔腸道活動力極顯著提高（P＜0.01）。

圖1 檸檬酸對鼠腸道平滑肌收縮影響波形圖

圖2 檸檬酸對鼠腸道活力的影響

圖3 檸檬酸對兔腸道平滑肌收縮影響波形圖

圖4 檸檬酸對兔腸道活力的影響

2.3 檸檬酸對小鼠生長與消化功能的影響 圖5結果顯示，隨著時間推移，小鼠體重不斷增加，與對照組相比，檸檬酸濃度為0.1 g/L 時，小鼠14 d 體重差值最高。

圖5 檸檬酸對小鼠的生長影響

消化酶活性測定結果見圖6、圖7 和圖8。 與對照組相比，0.1 g/L 濃度組胃蛋白酶活力和血清胰蛋白酶活力有增長趨勢。 腸內容物胰蛋白酶活力結果表明，與對照組相比，0.1 g/L 濃度組極顯著提高（P＜0.01），0.15 g/L 濃度組顯著提高（P＜0.05）。

圖6 檸檬酸對胃蛋白酶活性的影響

圖7 檸檬酸對血清胰蛋白酶活性的影響

圖8 檸檬酸對腸胰蛋白酶活性的影響

由圖9 可知， 與對照組相比， 檸檬酸濃度達到0.1 g/L 和0.15 g/L 時， 小腸絨毛長度與隱窩深度比值極顯著增高（P＜0.01）。

3 討 論

圖9 檸檬酸對腸絨毛長度與隱窩深度比值的影響

3.1 檸檬酸的抑菌作用 本試驗選擇革蘭氏陽性菌葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌進行檸檬酸抑菌圈試驗。試驗結果表明，不同濃度檸檬酸對大腸桿菌和葡萄球菌的生長均有抑制效果， 隨著檸檬酸濃度增加，抑菌效果越好。 大腸桿菌培養基中15%濃度檸檬酸的抑菌效果與頭孢噻肟相當， 葡萄球菌培養基中15%濃度檸檬酸的抑菌效果與阿莫西林相當。 朱愛民等[6]研究發現酸化劑處理斷乳仔豬能使其糞便中大腸桿菌和沙門氏菌顯著降低。除此之外，孫建華等[7]研究發現酸化劑不僅能顯著降低腸道有害菌的數量， 而且能顯著提高腸道有益菌乳酸桿菌的數量。 鄭建婷等[8]試驗得出飼糧中添加檸檬酸能增加優勢菌屬的種類，從而提高微生物多樣性。

3.2 檸檬酸對腸道平滑肌收縮功能的影響 腸道的消化吸收能力與腸道平滑肌的收縮功能密切相關。 本試驗結果表明，與空白對照組相比，含0.1 g/L和0.15 g/L 檸檬酸的臺氏液環境能極顯著提高鼠與兔的腸道活動力。 適當的H+濃度促進鈣通道激活，肌纖蛋白對Ca2+敏感性升高，肌質網釋放Ca2+增多，故平滑肌收縮力加強[9]，檸檬酸添加濃度過高或時間過長均會改變腸道活動力。

3.3 檸檬酸對物質代謝與營養功能的影響

3.3.1 檸檬酸對生長性能的影響 在飲水或飼料中添加適量的檸檬酸，能提高動物生長性能。本試驗結果表明，檸檬酸能提高小鼠的增重，促進小鼠生長，以飲水中添加0.1 g/L 檸檬酸效果最佳。 Liao 等[10]報道在15～35 日齡肉鴨飲水中添加檸檬酸(0.068%)不僅能降低大腸桿菌數量，還可提高肉鴨采食量，從而達到提高生長性能的目的。 在飼料中添加檸檬酸不僅能提高腸道消化吸收能力，還能改善日糧適口性。池仕紅等[11]研究表明不同種類的酸化劑均能提高斷乳仔豬生長性能。 何榮香等[12]通過試驗證明在斷乳仔豬飼糧和飲水中單獨或組合添加有機酸均可提高斷乳仔豬的生長性能。大量研究表明，檸檬酸可以提高動物采食量， 提高其生長性能， 促進動物健康成長，與本試驗結果一致。

3.3.2 檸檬酸對消化酶活性的影響 pH 是影響消化道酶活性的重要因素之一， 消化酶在偏酸性的環境中發揮作用更強，尤其是胃蛋白酶，檸檬酸能促進無活性的胃蛋白酶原轉化為具有活性的蛋白酶，以有效水解蛋白質[13]。 本試驗表明檸檬酸可以提高胃蛋白酶和血清蛋白酶活性， 但不同濃度組別間差異不顯著。我們研究發現飼喂檸檬酸濃度0.1 g/L 飲用水的小鼠，其腸內容物胰蛋白酶活性極顯著提高。與孫建華等[7]研究兩種復合酸化劑對肉雞胃蛋白酶、胰蛋白酶活性的影響結果相似。

3.3.3 檸檬酸對小腸黏膜形態及絨毛隱窩比的影響小腸是動物機體進行消化吸收的主要場所。 良好的小腸黏膜形態結構對促進腸道生理功能有重要的作用。 小腸絨毛加長，隱窩加深，可使小腸與食糜接觸的面積增加，促進營養物質消化吸收。本研究結果顯示，與對照組相比，檸檬酸濃度為0.1 g/L 和0.15 g/L的試驗組，小腸絨毛隱窩比極顯著提高。程卓等[14]研究檸檬酸對草魚腸道組織形態影響， 發現添加0.15%～0.45%檸檬酸的草魚腸道絨毛高度顯著提高。 王慶爭等[15]研究表明0.1%酸化劑在與血漿蛋白粉合用情況下能使28 日齡、35 日齡仔兔的十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度顯著增加，隱窩深度顯著降低。

4 結 論

檸檬酸有促進機體生長及提高消化功能的作用，主要通過抑制有害菌的生長、提高消化道平滑肌的收縮強度及頻率、 促進消化酶活性及改善腸道黏膜形態、 增大營養物質的消化吸收面積來實現。 綜合本試驗結果， 以添加檸檬酸濃度為0.1 g/L 和0.15 g/L 效果較好。