鵝圓環(huán)病毒TB Green 實時熒光定量PCR 方法的建立及初步應(yīng)用

趙 敏 李家玉 黃 瑜 萬春和＊

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心/福建省禽病防治重點實驗室 福州 350013）

鵝圓環(huán)病毒（Goose circovirus，GoCV）屬于圓環(huán)病毒科 （Circoviridae） 圓環(huán)病毒屬 （Circovirus）[1]。GoCV 基因組為共價閉合環(huán)狀、 單股負(fù)鏈DNA。 目前，基因組大小有三種，分別為：1 820 nt（僅2 株，GenBank 登錄號AF536939 和AF536938）、1 821 nt和1 822 nt （僅1 株，GenBank 登錄號KT207809）。GoCV 基因組編碼4 個大的主要開放閱讀框（ORF）：V1 （nt72/73 -953）、C1 （nt1760/1761 -1008）、V2（nt1612/1613-1725）和C2（nt426/427-127）。 是無囊膜的二十面體病毒粒子，其直徑約20 nm，為目前已知的最小鵝類病毒。 鵝圓環(huán)病毒首次是由德國學(xué)者Soike 在1999 年德國勃蘭登南部地區(qū)一群發(fā)育遲緩的鵝中發(fā)現(xiàn)[2]。 隨后在我國臺灣[3]、浙江[4]、重慶[5]、江西[6]、山東[7]、福建[8]、廣東[9]、新疆[10]等地相繼被發(fā)現(xiàn)。GoCV 與鴨圓環(huán)病毒等圓環(huán)病毒屬成員相似，GoCV是一種潛在的免疫抑制病毒， 主要感染宿主的淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致宿主的免疫功能下降，生長遲緩，且增加繼發(fā)感染其他病原的概率，危害極大，給鵝的養(yǎng)殖帶來了極大的困難，同時造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失，目前對于GoCV 還沒有有效的治療手段[11-12]。

由于TB Green 實時熒光定量PCR 方法具有高特異性、高敏感性、良好的重復(fù)性以及可定量等諸多優(yōu)勢，已成為病原檢測最常用的方法之一[13]。本研究根據(jù)GenBank 中的GoCV 序列設(shè)計實時熒光定量PCR 的引物和構(gòu)建載體獲得陽性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，以此建立鵝圓環(huán)病毒的TB Green 實時熒光定量檢測方法。為鵝圓環(huán)病毒的預(yù)防提供有效的手段，同時為鵝圓環(huán)病毒核酸流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 毒株及臨床樣品 試驗用鴨源鴨圓環(huán)病毒I 型（Duck circovirus type I，DuCV-I）、鴨源鴨圓環(huán)病毒II 型（Duck circovirus type II，DuCV-II）、鴨 源禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、鴨源霍亂巴氏桿菌（Pasteurella multocida，PM）、 鴨源大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli） 和 鴨 疫 里 默 氏 菌（Riemerella anatipestifer，RA） 均由本課題組鑒定和保存。

64 份鵝組織樣品來自2019～2021 年廣東、福建、湖北、江西和上海5 個省份（直轄市）地方水禽養(yǎng)殖場送檢樣品。

1.2 主要試劑與耗材 病毒DNA/RNA 提取試劑盒、 一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌DNA 提取試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司；PCR 擴(kuò)增試劑盒Thermo Scientific Dream Taq Green PCR Master Mix 購自Thermo Fisher Scientific 公司； 實時熒光定量試劑盒TB Green Premix DimerEraser、pMD20-T vector、大腸桿菌 （Escherichia coli）DH5α，DNA Marker 分 子 量2000 均購自寶生物（TaKaRa，大連）公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒I Plasmid Mini Kit I D6943 和膠回收試劑盒Gel Extraction Kit D2500 購自O(shè)mega（美國）公司；PCR-0208-C 管購自Axygen（美國）公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成 從NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得GoCV 全長序列，利用Oligo.v7.37 引物設(shè)計軟件，在保守區(qū)域設(shè)計GoCV 特異性實時熒光定量PCR 引物，上游引物GoCV-F：5′- GTTCACCGACTCGAAGGTATG-3′、下游引物GoCV-R：5′- GTCTGCGAAAGAATGCGAAAG -3′，目的片斷大小為138 bp。上述引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 核酸的提取 利用DNA 核酸提取試劑盒提取GoCV、DuCV-I、DuCV-II； 利用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取PM、E. coli 和RA 核酸；利用RNA 試劑盒提取AIV 核酸RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的病毒RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 備用。

1.5 GoCV 陽性質(zhì)粒的構(gòu)建 本研究的陽性標(biāo)準(zhǔn)品為陽性重組質(zhì)粒 （pMD-GoCV）， 制備見參考文獻(xiàn)[6]。 經(jīng)分光光度計測定其濃度后計算出陽性質(zhì)粒拷貝數(shù)為5.41×109拷貝/μL， 將該陽性質(zhì)粒進(jìn)行10 倍連續(xù)倍比稀釋，凍存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 反應(yīng)條件優(yōu)化 實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系按照TB Green 說明書配制， 反應(yīng)總體積為20 μL。為確定反應(yīng)的最佳引物量， 分別設(shè)置（稀釋濃度為10 μmol/L）0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 μL 等不同的引物量進(jìn)行反應(yīng)；為確定最佳退火溫度，分別設(shè)置不同的退火溫度（53～60 ℃）進(jìn)行反應(yīng)。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以不同濃度 （5.41×104～5.41×106拷貝/μL）的pMD-GoCV 質(zhì)粒為模板，利用優(yōu)化后的TB Green 實時熒光定量PCR 方法的最佳反應(yīng)條件，進(jìn)行實時熒光定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)后得到擴(kuò)增曲線和熔解曲線。以Ct 值（循環(huán)數(shù)閾值）為縱坐標(biāo)， 以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的起始拷貝數(shù)的常用對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制實時熒光定量PCR 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 敏感性試驗 以不同濃度 （5.41×106～5.41×100拷貝/μL）的pMD-GoCV 質(zhì)粒為模板，利用優(yōu)化后的TB Green 實時熒光定量PCR 檢測方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)， 確定該實時熒光定量PCR 方法的最低檢測限。

1.9 特異性試驗 以所提取的GoCV 病毒DNA 為陽性對照，對水禽常見病原（DuCV-I、DuCV-II、PM、E. coli、RA 和AIV） 利用優(yōu)化后的TB Green 實時熒光定量PCR 檢測方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)， 評價建立的GoCV 實時熒光定量PCR 檢測方法的特異性。

1.10 重復(fù)性試驗 以不同濃度 （5.41×102～5.41×106拷貝/μL）的pMD-GoCV 質(zhì)粒為模板，利用優(yōu)化后的TB Green 實時熒光定量PCR 方法的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)，檢驗該方法的重復(fù)性。每個濃度的質(zhì)粒做4 次重復(fù)，測定組內(nèi)變異系數(shù)。將上述不同濃度的pMD-GoCV 質(zhì)粒保存放置于-20 ℃，在凍存后第7 d、14 d、21 d 分別取出作為模板進(jìn)行檢測，測定不同批次試驗的組間變異系數(shù)。

1.11 臨床樣品檢測 對2019-2021 年廣東、福建、湖北、江西和上海5 個省份（直轄市）地方水禽養(yǎng)殖場送檢的64 份鵝組織臨床樣品按照常規(guī)方法處理，用病毒核酸提取試劑盒提取DNA， 利用建立的TB Green 實時熒光定量PCR 方法進(jìn)行GoCV 感染的檢測，同時用常規(guī)PCR 方法[3]檢測以上樣品，比較兩種方法的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化后的實時熒光定量PCR 反應(yīng)條件 TB Green 實時熒光定量PCR 優(yōu)化的最佳反應(yīng)體系（20 μL）：2 ×TB Green Mix 10 μL、 濃 度 均 為10 μmol/L 的 上 游 引 物 （GoCV-F） 和 下 游 引 物（GoCV-R）各0.6 μL、模板1 μL，ddH2O 7.8 μL。 優(yōu)化的TB Green 實時熒光定量PCR 方法的反應(yīng)程序： 預(yù)變性，95 ℃、2 min；95 ℃、10 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35 個循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 通過擴(kuò)增曲線可見，建立的GoCV 實時熒光定量PCR 檢測方法， 擴(kuò)增效率為98.0%，相關(guān)系數(shù)為1.00，當(dāng)模板起始濃度在5.41×104~5.41×106拷貝/μL 時，具有很好的線性關(guān)系。 以Ct 值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒起始拷貝數(shù)的常用對數(shù)為橫坐標(biāo)， 獲得TB Green 實時熒光定量PCR 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），曲線的斜率為-3.424，Y 軸截距為38.41， 表明建立的檢測GoCV 的TB Green 實時熒光定量PCR 方法線性關(guān)系良好。

圖1 GoCV TB Green 實時熒光定量PCR 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 敏感性試驗 以不同質(zhì)粒濃度為模板，利用優(yōu)化后的TB Green 實時熒光定量PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果見圖2，該方法最低檢測限為5.41×101拷貝/μL，表明建立的方法敏感性好。

2.4 特異性試驗 由擴(kuò)增曲線（見圖3）可知，建立的TB Green 實時熒光定量PCR 方法僅能擴(kuò)增GoCV，對其他水禽常見病原（如鴨圓環(huán)病毒I 型、鴨圓環(huán)病毒II 型、禽流感病毒、霍亂巴氏桿菌、大腸桿菌和鴨疫里默氏菌）均不能擴(kuò)增。

圖2 GoCV TB Green 實時熒光定量PCR 方法敏感性

圖3 GoCV TB Green 實時熒光定量PCR 的特異性

圖4 GoCV TB Green 實時熒光定量PCR 的熔解曲線

通過分析熔解曲線（見圖4）可知，建立的TB Green 實時熒光定量PCR 方法檢測GoCV 僅出現(xiàn)1個特異的單峰，Tm=（84.46±0.09）℃，無引物二聚體，無非特異性擴(kuò)增。 水禽其他常見病原（鴨圓環(huán)病毒I型、鴨圓環(huán)病毒II 型、禽流感病毒、霍亂巴氏桿菌、大腸桿菌和鴨疫里默氏菌）均無特異性擴(kuò)增，表明本研究建立檢測GoCV 的TB Green 實時熒光定量PCR 方法特異性強。

2.5 重復(fù)性試驗 以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，利用建立的方法進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗， 檢測結(jié)果見表1，組內(nèi)重復(fù)的變異系數(shù)為0.26%~0.55%，組間重復(fù)的變異系數(shù)為0.23%~0.87%， 表明本研究建立的TB Green 實時定量PCR 方法重復(fù)性好。

表1 實時熒光定量PCR 的重復(fù)性試驗

2.6 臨床樣品的檢測 利用建立的TB Green 實時熒光定量PCR 方法和常規(guī)PCR 方法，同時對64 份臨床送檢的鵝組織病料樣品進(jìn)行GoCV 感染的檢測，結(jié)果見表2。 常規(guī)PCR 方法只檢出15 份GoCV陽性，陽性率為23.44%；建立的TB Green 實時熒光定量PCR 方法檢出18 份GoCV 陽性， 陽性率為28.13%， 且15 份常規(guī)PCR 檢測的陽性樣品利用本研究建立的TB Green 實時熒光定量PCR 方法檢測均為陽性， 與常規(guī)PCR 相比， 本研究建立的TB Green 實時熒光定量PCR 方法敏感性更好。

表2 臨床樣品的檢測

3 討 論

鵝圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒屬成員， 與鴨圓環(huán)病毒一樣屬于圓環(huán)病毒科。 該病毒感染鵝后會引起免疫功能下降， 生長遲緩， 導(dǎo)致病原二次感染或共感染[14]。 有研究報道，GoCV 感染宿主17~30 d 會導(dǎo)致腹瀉、 生長遲緩和羽毛疾病， 檢測發(fā)現(xiàn)宿主的法氏囊、胸腺、脾臟等多個組織器官被感染，其中法氏囊的病毒載量相對較多， 組織學(xué)檢查顯示法氏囊中的淋巴細(xì)胞減少和組織細(xì)胞增多以及以肺、 肝和腎中的淋巴浸潤為特征的炎癥[15]。 還發(fā)現(xiàn)鵝圓環(huán)病毒與多種病毒共感染，導(dǎo)致病死率增大[16-17]，由此可見，GoCV 對鵝養(yǎng)殖業(yè)危害極大。

本研究基于GoCV 保守區(qū)域建立的TB Green實時熒光定量PCR 方法具有以下優(yōu)點： 特異性強，只對GoCV 進(jìn)行擴(kuò)增， 對其他水禽常見病原 （如GoCV、DuCV-I、DuCV-II、PM、E. coli、RA 和AIV）均不能擴(kuò)增； 重復(fù)性好， 組內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)最高為0.55%，組間變異系數(shù)最高為0.87%；靈敏度高，最低檢測限為5.41 拷貝/μL。 利用建立的TB Green 實時熒光定量PCR 方法和常規(guī)的PCR 方法， 同時對2019-2021 年廣東、福建、湖北、江西和上海5 個省份（直轄市）地方水禽養(yǎng)殖場送檢的64 份鵝組織臨床樣品進(jìn)行GoCV 感染的檢測，均檢測到GoCV，其中使用本研究建立的TB Green 實時熒光定量PCR方法檢出18 份陽性，陽性率為28.13%。前期有報道表明，來源于黑龍江、遼寧、河北、山東、河南、江蘇、四川、安徽、湖南、江西和廣東11 個省份的鵝組織樣本的總體GoCV 陽性率為21.7%[17]。本研究對2019-2021 年廣東、福建、湖北、江西和上海5 個省份（直轄市）地方水禽養(yǎng)殖場送檢的64 份鵝組織樣品的陽性率為28.13%，陽性率較高，可能與樣品類型和地域不同等因素有關(guān)。