禽類肌肉中氟苯尼考殘留檢測方法對比分析

劉碧玉 周偉靚 福建省農產品質量安全檢驗檢測中心 福州 350003

氟苯尼考（Forfenicol，FF）是廣泛應用于畜牧業生產環節的酰胺醇類藥物，因氟苯尼考與多西環素（DOX）的復方制劑經臨床試驗證明可顯著提高禽類養殖過程中生存質量及存活率， 增加養殖戶經濟效益。 目前， 檢測禽類肌肉中氟苯尼考藥物殘留的方法主要有高效液相色譜熒光檢測法、 液相色譜-串聯質譜法和酶聯免疫法。 由于酶聯免疫法僅適用于初篩和快檢，基于氟苯尼考殘留確證定量檢測，本試驗以擬建立的高效液相色譜熒光檢測法和液相色譜-串聯質譜法為禽類肌肉質量控制 （氟苯尼考殘留）提供基礎支撐。

1 材料和方法

1.1 高效液相色譜熒光檢測法

1.1.1 儀器和試劑 2695 高效液相色譜儀，沃特世Waters 科技有限公司；ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱，沃特世Waters 科技有限公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；AR3130 電子天平，奧豪斯（上海公司）；D-37520 高速冷凍離心機，美國科俊儀器有限公司；N-EVAP 112 氮吹儀，美國Organomation 有限公司；MS3 digital 渦旋混勻器，德國IKA 有限公司。 氟苯尼考標準品，含量為99.8%，購自Dr.Ehrenstorfer 公司； 優級純甲醇、 色譜純乙腈、色譜純正己烷，均購自默克股份兩合公司；分析純乙酸乙酯，國藥集團化學試劑有限公司；色譜純甲酸，美國阿拉丁工業公司。

1.1.2 檢測方法與步驟

1.1.2.1 標準品溶液配制 稱取氟苯尼考標準品10 mg（精密稱定，標準品含量為99.8%），置100 mL棕色容量瓶中， 加色譜純乙腈定容至刻度， 配制成100 μg/mL 標準儲備溶液，-20 ℃冰箱保存。

取1 mL 標準儲備溶液于100 mL 棕色容量瓶中，用色譜純乙腈定容至刻度，配制成1 μg/mL 標準工作溶液，-20 ℃冰箱保存。

取1 mL 標準工作溶液于10 mL 棕色容量瓶中，用色譜純乙腈定容至刻度，配制成100 ng/mL 標準溶液，臨用前現配。

1.1.2.2 樣品中氟苯尼考有效成分提取 稱取2.0 g（精確到0.001 g） 均質的禽肉樣品于50 mL 離心管中，加色譜純乙腈15 mL，加入一顆均勻子，渦動提取1 min，8 000 r/min 離心5 min， 提取液轉移至50 mL 離心管中，重復提取一次，合并提取液，50 ℃下氮吹近干，加2 mL 水使殘渣溶解，加入5 mL 色譜純正己烷， 渦旋提取1 min， 靜置分層或8 000 r/min 離心5 min，棄掉上層的正己烷層，再加5 mL 色譜純正己烷， 渦旋提取1 min， 靜置分層或8 000 r/min 離心5 min，棄掉上層的正己烷層，取下層清液過0.22 μm 濾膜，上機測定。

1.1.2.3 高效液相色譜條件 BEH -C18 柱（2.1 mm× 150 mm，5 μm）或相當者；流動相：水:甲醇=75:35； 流速：1 mL/min； 柱溫：40 ℃； 進樣量：10 μL；測定波長：230 nm。

1.2 液相色譜-串聯質譜法

1.2.1 儀器和試劑 超高效液相色譜/氣相色譜串聯質譜儀，Waters 沃特世科技（上海）有限公司；Waters TQ-S UPLC/MS/MS BEH-C18 柱，Waters 科 技有限公司；電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；AR3130 電子天平，奧豪斯（上海公司）；D-37520 高速冷凍離心機， 美國科俊儀器有限公司； N-EVAP 112 氮吹儀， 美國Organomation 有限公司；MS3 digital 渦旋混勻器， 德國IKA 有限公司。 氟苯尼考標準品， 含量為99.8%， 購自Dr.Ehrenstorfer 公司；優級純甲醇、乙腈、正己烷，均購自默克股份兩合公司；分析純乙酸乙酯，國藥集團化學試劑有限公司； 優級純甲酸， 美國阿拉丁工業公司。

1.2.2 試驗方法與步驟

1.2.2.1 標準溶液配制 混合標準工作液的配制：精密量取標準儲備液 （同高效液相色方法）0.1 mL，置100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到1 μg/mL 混合標準工作液。 精密量取1 μg/mL 混合標準工作液1 mL，置10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到100 ng/mL 混合標準工作液。

1.2.2.2 樣品前處理 準確稱取5.0 g （精確至0.01 g）均質的禽肉或禽蛋樣品于50 mL 離心管中，加入15 mL 乙酸乙酯和0.5 mL 氨水， 渦旋提取1 min，8 000 r/min 離 心5 min， 上 清 液 轉 入 另 一50 mL 離心管中； 重復提取一次， 離心后合并上清液，取6 mL 上清液到15 mL 離心管中，50 ℃氮吹近干，待凈化。

用1 mL 0.5%甲酸乙腈/水溶液復溶，渦旋30 s，加入5 mL 飽和正己烷，渦旋1 min，棄去上層正己烷；重復操作3 次，取下層清液過0.22 μm 濾膜后上機測定。 同法做樣品空白試驗。

1.2.2.3 質譜條件 掃描方式： 多反應離子監測（MRM）；離子源：電噴霧離子源（ES+）；離子源溫度：150 ℃； 離子源噴霧電壓：3.0 kV ES+； 霧化溫度：550 ℃；霧化氣流速：900 L/h；錐孔氣流速：150 L/h。

2 結果與對比分析

2.1 標準曲線 分別量取（1 00 ng/mL） 標準溶液0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL 和2.00 mL，置于10 mL 棕色容量瓶中， 用流動相定容至刻度，混勻， 配 制 成 濃 度 為0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 和200 ng/mL 的標準溶液，上機測定，繪制標準曲線（見圖1-圖2）。 在樣品中添加一定量的混合標準使用液， 按HPLC 和LC-MS/MS 方法要求進行樣品前處理，分別上高效液相色譜儀和超高效液相色譜/氣相色譜串聯質譜儀檢測，按稱樣量計，對相應濃度定量限進行計算。計算線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限與定量限，從表1 可見， 氟苯尼考標準溶液在5～200 ng/mL 具有良好的線性關系， 高效液相色譜熒光檢測法相關系數為0.9993， 液相色譜-串聯質譜法相關系數為0.9991；高效液相色譜熒光法檢出限為10 μg/kg、 定量限30 μg/kg，液相色譜-串聯質譜法檢出限為5 μg/kg、定量限10 μg/kg， 高效液相色譜熒光檢測法與液相色譜-串聯質譜法均能達到氟苯尼考殘留檢測要求。

圖1 HPLC 標準曲線

圖2 LC-MS/MS 標準曲線

表1 線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量限

表2 平行測定樣品的加標回收率

2.2 樣品檢測和加標回收率 選取市售鴨肉、雞肉各一份， 按照高效液相色譜熒光檢測法與液相色譜-串聯質譜法進行樣品處理、測定，均未檢出氟苯尼考殘留。按方法要求稱取樣品，分別加入5 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg 標準溶液，每個濃度水平做6 個平行測定， 按照兩種方法要求進行樣品前處理、測定，從表2 可見，高效液相色譜熒光檢測法的樣品加標回收率為82.0%～92.0%，液相色譜-串聯質譜法為90.0%～100.0%；高效液相色譜熒光檢測法的相對標準偏差為1.34%～3.78%， 液相色譜-串聯質譜法為1.95%～3.68%。 可見，高效液相色譜熒光檢測法與液相色譜-串聯質譜法相關試驗表現均符合氟苯尼考藥物殘留檢測要求。

3 結 論

高效液相色譜熒光檢測法與液相色譜-串聯質譜法的樣品加標回收率分別為82.0%～92.0%、90.0%～100.0%，相對標準偏差（RSD）均小于5%，達到相關檢測標準要求，適用于氟苯尼考在禽類肌肉藥物代謝動力學的研究。 高效液相色譜儀已較為普及，禽類肌肉樣品處理操作工序相近的情況下，使用高效液相色譜熒光檢測法，干擾因素較少，在不具備液相色譜-串聯質譜法試驗條件的地區或單位，高效液相色譜熒光檢測法的試驗結果同樣具有參考價值， 為檢驗條件相對落后的地區或單位在畜牧業的藥物代謝動力學及其他應用研究提供基礎性試驗支撐。