雞壞死性腸炎診斷技術(shù)

張 艷 馮萬(wàn)宇 薛沾枚 劉雪松 張 備 徐 馨 張國(guó)華 吳 憲 王 巖 史同瑞

黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院 黑龍江齊齊哈爾 161005

雞壞死性腸炎屬于“腸毒血癥” 的一種表現(xiàn)類型，主要由A 型和部分C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起。 由英國(guó)學(xué)者Parish 在1961 年首次報(bào)道，隨后Parish 制備動(dòng)物模型， 成功用產(chǎn)氣莢膜梭菌人工復(fù)制出雞壞死性腸炎， 隨后雞壞死性腸炎在全世界其他國(guó)家的養(yǎng)禽場(chǎng)所相繼報(bào)道， 對(duì)全世界養(yǎng)禽業(yè)產(chǎn)生了巨大沖擊[1]。 據(jù)報(bào)道，全球每年因壞死性腸炎暴發(fā)造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)20 多億美元[2]。

長(zhǎng)期以來(lái)， 全球的養(yǎng)殖業(yè)對(duì)疾病的應(yīng)對(duì)措施依賴于抗生素的使用， 在集約化飼養(yǎng)中向畜禽基礎(chǔ)日糧中添加低劑量的抗生素較為普遍， 因?yàn)槠涞统杀镜耐度爰纯纱龠M(jìn)動(dòng)物增重、降低發(fā)病率和病死率，為從業(yè)者帶來(lái)豐厚的經(jīng)濟(jì)收益[3]。 但是，長(zhǎng)期的抗生素使用使動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生了一些對(duì)抗生素抗性較強(qiáng)的耐藥菌株， 并且在相關(guān)動(dòng)物制品及廢棄物中也檢測(cè)到了抗生素，嚴(yán)重危害了公共生態(tài)安全和食品安全[4]。所以，歐盟在2006 年對(duì)此立法，禁止向動(dòng)物飼料中添加抗生素，隨之而來(lái)是畜禽的發(fā)病率顯著升高，其中，禽壞死性腸炎發(fā)病率增高明顯，對(duì)全球養(yǎng)禽業(yè)產(chǎn)生了巨大沖擊[5]。 所以，雞壞死性腸炎的早期診斷變得尤為重要。該文對(duì)壞死性腸炎診斷技術(shù)進(jìn)行詳述，以期及早發(fā)現(xiàn)該病并采取相應(yīng)診治措施。

1 病 原

壞死性腸炎是1961 年在英國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的一種禽類腸道疾病，A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌是壞死性腸炎的主要致病菌，其次為C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌[1]。 產(chǎn)氣莢膜梭菌又稱為魏氏梭菌， 是一種革蘭氏陽(yáng)性厭氧芽孢桿菌，是人和動(dòng)物腸道的常在菌，分為A、B、C、D 和E 等5 個(gè)型。 產(chǎn)氣莢膜梭菌在繁殖過(guò)程中能產(chǎn)生多種具有致病作用的外毒素和酶，目前發(fā)現(xiàn)的有ɑ、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν 和NetB 毒素以及許多透明質(zhì)酸酶和唾液酸酶等， 其中ɑ、β、ε 和ι 是主要的致死毒素[6]。 產(chǎn)氣莢膜梭菌在動(dòng)物健康情況下棲息于嗉囊、小腸和盲腸中，不會(huì)引起機(jī)體發(fā)病，當(dāng)腸黏膜受損或腸道菌群失調(diào)時(shí)，會(huì)在消化道前段大量增殖，導(dǎo)致壞死性腸炎的發(fā)生和雞只死亡[7]。

2 流行病學(xué)

該病一年四季都可發(fā)生， 在潮濕悶熱的夏秋季節(jié)發(fā)生較多。 傳染源是患雞及隱性感染雞。 以2~5 周齡，特別是3 周齡肉雞最易感。 5 周齡以上蛋雞易感。平養(yǎng)雞比籠養(yǎng)雞更易感。一般經(jīng)消化道傳播，也可垂直傳播[8]。

3 臨床癥狀

3.1 臨床型 以突然發(fā)病、急性死亡為特征，多數(shù)未表現(xiàn)任何臨床癥狀在1~3 d 死亡。

3.2 亞臨床型 病死率較低， 主要表現(xiàn)為食欲減退、腹瀉、肛周常黏有糞便等污物、生長(zhǎng)緩慢，料重比增高、生產(chǎn)性能下降，常引起其他病原的繼發(fā)感染。

3.3 慢性型 患雞偏瘦，精神沉郁，羽毛雜亂，食欲減退，畏寒扎堆，雙翅低垂，運(yùn)動(dòng)失調(diào)，有的患雞還表現(xiàn)嗉囊腫脹，有的腹瀉，糞便帶血或呈黑褐色煤焦油樣，偶見糞便中混有腸組織黏膜，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩。

4 剖檢病變

剖開病死雞的腹腔，可聞到明顯的尸腐臭味。小腸病變最為典型，尤其表現(xiàn)在空腸、回腸，腸管擴(kuò)張、臌氣導(dǎo)致明顯增粗， 體積約是正常腸管的2~3 倍。腸黏膜變厚，腸腔內(nèi)含帶鮮血的黃褐色至發(fā)黑稀便，腸壁明顯充血，可見出血點(diǎn)。腸黏膜上有大小和形狀各異的麩皮樣壞死斑， 病情嚴(yán)重時(shí)可見腸黏膜上形成壞死性偽膜，易剝離，腸管彈性喪失、易斷。有時(shí)可見肝臟、膽管腫大，在肝臟表面有灰黃色壞死灶，有時(shí)有黃豆粒大小的多發(fā)性囊腫。 腫大的膽管內(nèi)可見大量黏稠膽汁。

5 病原學(xué)診斷

5.1 病料采集 病料的采集方法按NY/T 541 的規(guī)定進(jìn)行。 病料包括小腸病變部位內(nèi)容物、 體腔滲出液及各病變臟器。

5.2 病原鑒定

5.2.1 病原檢測(cè)程序 按圖1 所示進(jìn)行。

圖1 產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)與鑒定程序圖

5.2.2 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

5.2.2.1 菌落特征 在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上， 可形成2～5 mm、圓形、邊緣整齊、灰色至灰黃色、表面光滑半透明、圓屋頂狀菌落，偶爾見裂葉狀邊緣的粗糙菌落及絲狀邊緣的不規(guī)則扁平菌落， 菌落周圍有溶血環(huán)， 大多數(shù)菌株可產(chǎn)生雙環(huán)溶血。 在胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸 （TSC） 卵黃瓊脂培養(yǎng)基夾層中可見周邊有透明環(huán)的黑色圓菌落，有時(shí)菌落周圍有氣泡。

5.2.2.2 細(xì)菌形態(tài) 菌體呈直桿狀、 兩端鈍圓，大小為（0.6～2.4）μm×（1.3～19.0）μm，單個(gè)或成雙，短鏈很少出現(xiàn)，革蘭氏陽(yáng)性。 無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)。 芽孢大而卵圓，位于菌體中央或近端，使菌體膨脹。 多數(shù)菌株可形成莢膜，對(duì)細(xì)菌負(fù)染可見到莢膜。

5.2.3 生化試驗(yàn) 按GB 4789.13 的規(guī)定進(jìn)行。

5.2.4 PCR 鑒定

5.2.4.1 引物序列 參考文獻(xiàn)中提到的引物[9]。上游引物F：5′-GTTGATAGCGCAGGACATGTTAAG-3′；下游引物R：5′-CATGTAGTCATCTGTTCCAGCATC-3′。

5.2.4.2 模板制備 挑取可疑菌落， 加入含20 μL滅菌去離子水的PCR 離心管中， 壓緊管蓋， 煮沸10 min，再冰浴10 min，離心取上清液作為PCR 模板樣品。

5.2.4.3 反應(yīng)體系 可配制25 μL 反應(yīng)體系， 具體見表1。

5.2.4.4 反應(yīng)條件設(shè)置 各種試劑加樣后充分混勻，4 000 r/min 離心30 s，置入PCR 儀，設(shè)置程序如下： 第1 階段，94 ℃，2 min； 第2 階段，94 ℃、30 s，53 ℃、30 s，72 ℃延伸40 s，30 個(gè)循環(huán)； 第3 階段，72 ℃，10 min。

表1 PCR 反應(yīng)體系

5.2.4.5 凝膠電泳 PCR 產(chǎn)物與10×上樣Buffer 混合，加樣于1%瓊脂糖凝膠板中，設(shè)置電壓9 V/cm，20～40 min，在凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

5.2.4.6 結(jié)果判定 陽(yáng)性對(duì)照在402 bp 位置出現(xiàn)一條清晰條帶， 陰性和空白對(duì)照孔不應(yīng)出現(xiàn)任何條帶；若檢測(cè)樣品在402 bp 位置出現(xiàn)條帶，可確認(rèn)為產(chǎn)氣莢膜梭菌核酸檢測(cè)為陽(yáng)性， 無(wú)條帶或條帶的位置不是402 bp 的為陰性。

5.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 以細(xì)菌濃度為8×109cfu/mL的分離株菌液口腔灌服21 日齡健康雛雞，0.5 mL/羽，連續(xù)觀察7 d，臨床癥狀和剖檢病變都符合后，采集病料分離培養(yǎng)符合接種菌的特征， 則可判為動(dòng)物試驗(yàn)陽(yáng)性。

6 綜合判定

符合產(chǎn)氣莢膜梭菌形態(tài)特征、 生化試驗(yàn)、PCR鑒定和動(dòng)物回歸試驗(yàn)陽(yáng)性的，可確診雞壞死性腸炎。