一例豬圓環(huán)病毒3 型與豬繁殖與呼吸綜合征病毒共感染的診斷

邱 萍 仙游縣度尾畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務站 福建仙游 351200

豬圓環(huán)病毒3 型（PCV3）于2015 年美國豬群中首次發(fā)現(xiàn)，此后PCV3 迅速在世界范圍內(nèi)流行，中國豬群流行病學調(diào)查顯示68.6%豬群呈PCV3 感染抗體陽性[1]。該病毒常與豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（ PRRSV）和（或）豬瘟病毒（CFV）共感染，嚴重損害豬只呼吸道、消化道和生殖系統(tǒng)[2-3]。 PCV3 與PRRSV 共感染的豬群，臨床表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎，機體消瘦，呼吸道癥狀明顯[4-6]。現(xiàn)介紹一例PCV3 與PRRSV 共感染病例的診斷情況，為今后該類疾病的診治提供參考。

1 病例介紹

2021 年4 月， 福建某豬場母豬群陸續(xù)出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎，流產(chǎn)率30%左右。 保育豬群出現(xiàn)食欲不振、被毛粗糙、消瘦、呼吸困難等臨床癥狀，發(fā)病率60%。

2 臨床癥狀及剖檢病變

患豬被毛粗糙，呼吸困難（見圖1A）。 發(fā)病母豬流產(chǎn)，流產(chǎn)胎兒日齡90~100 d（見圖1B），剖檢病死豬見肺臟胰樣肉變， 呈斑駁狀， 質(zhì)地如橡皮（見圖1C）， 腹股溝淋巴結(jié)、 肺門淋巴結(jié)明顯腫大 （見圖1D）。

圖1 送檢患豬剖檢結(jié)果

3 實驗室檢查

3.1 主要試驗器材及試劑 儀器：PCR 基因擴增儀（寧波市雙嘉儀器有限公司）和小型電泳儀（C.B.S.公司）。 試劑：病毒DNA/RNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司、DNA 凝膠回收試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Prommega 生物技術(shù)有限公司。

3.2 DNA/RNA 提取 在清潔環(huán)境下采集患豬肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、腎臟等部位的病變組織，每個器官提取的量約為指甲蓋大小。 病變組織用放在冰上的勻漿機充分勻漿， 勻漿后的組織置冰箱反復凍融3 次，然后按8 000 r/min 離心15 min 取上清。 按試劑盒操作說明書提取DNA/RNA。

3.3 PCR 擴增 以提取病料DNA 為模板，用PCV2、PCV3 引物進行PCR 擴增，引物序列為PCV2（404 bp）：F: 5′ -CGGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGC-3′, R: 5′-TTA GG GTTTAAGTGGGGGGT-3′；PCV3 （330 bp）：F:5′-CCACAGAAGGCGCTATG TC -3′,R：5′-CCGCATAAGGGTCGTCTTG-3′[7]；以提取病料總RNA 進行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA； 用PRRSV、CFV 引物進行qRT-PCR 擴增， 引物序列為PRRSV（1 004 bp）：F:5′-CATTTCATACAC CTGAGACCAT-3′, R: 5′-AGATCATATAT CATCACT GGCT-3′[8]；CFV （184 bp）: 5′-ATCAGTCTCTGGAATTGTTGG CA-3′,R: 5′-CA AGCACGGATGAGGAATGCCG-3′，擴增的反應體系見表1。

表1 PCR 擴增反應體系及程序

將PCR 擴增產(chǎn)物加入1%瓊脂糖凝膠點樣孔，在120 V 條件下凝膠電泳45 min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍下凝膠圖像，PCR 產(chǎn)物送福州擎科生物科技有限公司測序。

3.5 基因同源性及遺傳變異分析 用生物學軟件DNAMAN 將測序結(jié)果與NCBI 庫GeneBank 的基因進行同源性及遺傳進化分析， 了解病毒的遺傳變異情況。

4 結(jié)果與分析

4.1 PCR 檢測結(jié)果 對病料樣品進行PCR/RTPCR 擴增，從凝膠電泳獲得的圖像可見，在PRRSV和PCV3 泳道中分別出現(xiàn)1 000 bp 左右和330 bp左右的條帶，獲得的條帶大小與預期相符合。PCV2、CFV 泳道未見明顯條帶， 在CFV 泳道見模糊雜帶，與預期條帶大小不符合（見圖2）。 PCR/RT-PCR 結(jié)果顯示送檢患豬存在PRRSV 與PCV3 共感染。

圖2 送檢病料PCR 檢測結(jié)果

圖3 測序結(jié)果同源性分析及遺傳進化分析結(jié)果

4.2 擴增產(chǎn)物同源性及遺傳進化分析結(jié)果 將RT-PCR/PCR 擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與GeneBank 篩選的相關(guān)基因序列對比可知（見圖3），PCV3 測序結(jié)果與篩選基因同源性普遍較高， 其中KY996338.1 序列同源性最高， 同源性為99.7%； 與MG87100、MN605935、MT473950 同源性為98.9%， 同源性最低； 通過遺傳進化樹分析可知，PCV3 測序結(jié)果與MK746099 遺傳關(guān)系最近，與MH547280，MN605935遺傳關(guān)系最遠。 PRRSV 測序結(jié)果與 JXA1（EF1124451）序列同源性最低，同源性僅為87.7%；與VR2332（EF536003.1）和MLV（AF159149.1）序列同源性最高，同源性為97.9%。 PRRSV 測序結(jié)果與MLV （AF159149.1）、TJ （EU860248.1） 和VR2332（EF536003.1）遺傳關(guān)系最近，與JXA1（EF112445.1）遺傳關(guān)系最遠。

5 討論與分析

對送檢病料進行核酸檢測顯示PCV3 和PRRSV 呈陽性， 因此該豬場豬群存在PCV3 與PRRSV 共感染。

5.1 PCV3 感染與PRRS 的臨床癥狀 PRRSV 可經(jīng)呼吸道和生殖道傳播， 傳播方式不僅可由懷孕母豬垂直傳給胎兒，還能通過糞便、唾液等排出物散播給周邊豬群， 而且引帶毒種群往往是導致豬群暴發(fā)該病的主要原因[9]。 PRRS 暴發(fā)時，懷孕母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎等現(xiàn)象；保育豬可能出現(xiàn)食欲不振、呼吸困難并且伴發(fā)高熱。 對患豬剖檢可發(fā)現(xiàn)肺部炎癥，肺葉出現(xiàn)明顯病變，淋巴組織水腫，脾臟發(fā)炎等癥狀[10]。

PCV3 在2016 年首次被發(fā)現(xiàn)并報道命名，主要危害的是保育豬群， 該病與PCV2 基因組同源性僅為37%~55%， 該病毒在流產(chǎn)的胎兒皮膚、 腎臟、肺和淋巴結(jié)中拷貝數(shù)較高[11]。PCV3 在健康豬群也可攜帶，不一定表現(xiàn)出臨床癥狀，但可能會降低豬群生長速度。 在臨床上大多存在PCV3 感染的豬群免疫力會下降，從而使得豬群腹瀉率升高，也可能會出現(xiàn)多系統(tǒng)炎癥和心肌炎，同時也會有呼吸道疾病、繁殖障礙等癥狀[12]。

5.2 PCV3 感染的防控 PCV3 傳播迅速， 可在家禽、家畜等動物間傳播，宿主范圍廣，還能夠同其他病原發(fā)生共感染。研究發(fā)現(xiàn)，健康狀況不佳更容易感染PCV3， 患有重度呼吸道疾病的豬群感染率（63.75%）顯著高于輕癥呼吸道疾病豬群（13.14%），患有消化道疾病的豬群感染率也顯著高于健康豬群[13]。 發(fā)病豬和隱性感染PCV3 的患豬是主要傳染源，能夠通過排泄物、唾液等污染周圍環(huán)境，最終傳染給健康豬群， 感染PCV3 的母豬也會將病毒垂直傳播給后代[14]。 目前市面上并無針對PCV3 的特效藥，養(yǎng)豬場禁止與其他動物同時飼養(yǎng)；飼養(yǎng)過程中加強飼養(yǎng)管理，提高整體豬群的健康度。將發(fā)病豬分群隔離飼養(yǎng)， 定期對母豬群進行PCV3 檢測， 及時淘汰檢測陽性母豬。

5.3 PRRS 的防控 養(yǎng)殖場應注重建立生物安全防控措施， 加強豬群飼養(yǎng)管理和環(huán)境控制。 在引豬時，加強檢疫措施，務必避免引入陽性帶毒種豬，在日常飼養(yǎng)管理中定期對飼養(yǎng)環(huán)境消毒， 采用全進全出飼養(yǎng)模式。 目前市面上有PRRSV 弱毒疫苗和滅活苗，弱毒苗的免疫效果明顯優(yōu)于滅活苗，在防控該病上取得一定成效， 但弱毒苗免疫后存在PRRSV毒力反強風險，在臨床上甚至出現(xiàn)接種疫苗后，突然暴發(fā)該疾病，因此在考慮使用該疫苗時需綜合考慮。