UV-B輻照對特早熟柑橘采后果皮色素的影響

楊 慧， 郭世澤， 伍 崢， 孫志偉， 唐天睿， 楊學虎

(1.云南農業大學 園林園藝學院， 云南 昆明 650100； 2.云南農業大學 熱帶作物學院， 云南 普洱 665000)

0 引言

【研究意義】紫外線可分為長波紫外線(UV-A，400～320 nm)、中波紫外線(UV-B，320～280 nm)和短波紫外線(UV-C，280～180 nm)[1]。其中，UV-C被臭氧層吸收，無法到達地面；UV-A雖能到達地面，但無明顯的生物學效應；UV-B能透過臭氧層到達地面，對植物產生有效輻射，顯著影響其生長發育[2]。柑橘(Citrus)是蕓香科(Rutaceae)植物，屬亞熱帶、熱帶常綠果樹，為全球第一大類果品、第三大國際貿易農產品[3]，是重要的經濟作物之一。云南氣候條件多樣，柑橘產業迅猛發展，寬皮柑橘類品種處于主導地位，由于得天獨厚的氣候優勢，篩選出興津、日南等早熟品種。早熟品種果實發育期較短[4-5]，從而導致其品質不佳，尤其是外觀品質，在果實著色期缺乏光照，使果實不能很好地完成轉色，嚴重影響其經濟價值。因此，在生產實踐中尋求改善特早熟柑橘外觀品質的采后處理技術具有重要的現實意義。【前人研究進展】近年來，利用紫外線采后處理果實的研究越來越多。紫外線輻照是影響植物體內葉綠素和類胡蘿卜素合成積累的重要因子，利用適宜的輻照對柑橘果實進行采后處理可有效改善其外觀品質，如增強UV-B輻照可改善檸檬[6]、杧果[7]和桃[8]的外觀品質。LIU等[9]研究表明，UV-B輻照可有效保持番茄采后感官品質并提高其抗氧化能力；IBDAH等[10]研究表明，離體UV-B輻照處理可以提高蘋果的營養價值和外觀品質但其味道未發生改變。【研究切入點】目前，有關UV-B輻照對特早熟柑橘采后果皮色素的影響研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】以云南特早熟柑橘興津為試材，探究不同UV-B輻照處理對其果皮色素的影響，以期為云南特早熟柑橘采后外觀品質的改善提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 特早熟柑橘品種興津，由華寧縣農業局亞熱帶水果示范園提供。

1.1.2 試劑 植物RNA提取試劑盒，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；cDNA合成試劑盒，購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；實時熒光定量試劑盒，購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。

1.2 試驗方法

試驗在云南省玉溪市華寧縣華溪鎮柑橘示范基地進行，于采收期采摘一批大小、形態、色澤品質均一的柑橘果實，在5℃、相對濕度85%貯藏條件下，用波長308 nm的UV-B燈管進行照射，通過調節光源距離設置輻照強度為100 μW/cm2，分別照射0 h(CK)、24 h和48 h。每隔10 d(0 d、10 d、20 d、30 d)從照射0 h、24 h、48 h處理中隨機選取3個果實樣品，測定其果皮色差、色素(葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素)含量及色素代謝相關基因的相對表達量。

1.2.1 果實色差測定 用3nh精密色差儀(NR110，三恩時科技有限公司)測定果皮色差，測定位置為果實赤道2點、頂部1點和底部1點，取平均值；測定L值(光澤明亮度，值越大代表越明亮)、a值(紅綠指標，正值為紅色程度、負值為綠色程度)和b值(黃藍指標，正值為黃色程度、負值為藍色程度)。

1.2.2 果皮色素測定 用丙酮︰乙醇︰水=4︰4︰1混合液提取葉綠素和類胡蘿卜素，用分光光度計〔A580,翱藝儀器(上海)有限公司〕在662 nm、645 nm、470 nm測定葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的吸光值，利用公式計算其含量[11]。

葉綠素a=12.72A662-2.59A645

葉綠素b=22.88A645-4.67A662

類胡蘿卜素=(1 000A470-3.27Ca-104Cb)/229

式中，A代表吸光值，Ca代表葉綠素a含量，Cb代表葉綠素b含量。

1.2.3 基因表達量測定 RNA的提取使用植物RNA提取試劑盒，反轉錄使用cDNA合成試劑盒。RNA提取后用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度，用2 μL的RNA模板和20 μL反應體系進行cDNA合成，于—20℃冰箱保存備用。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)使用熒光定量PCR儀(QuantStudio5，Applied Biosystems)、熒光定量試劑盒測定。β-actin基因為內參基金，引物為F(CCAAGCAGCATGAAGATCAA)和R(ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG)，基因引物序列見表1。反應體系：cDNA 2 μL，Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，總體系20 μL。反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火(延伸)30 s，40個循環。溶解曲線階段使用儀器默認設置，每個樣品設3次重復。測定結束后利用2-ΔΔCT法分析相對表達量。

表1 基因引物序列

1.3 數據統計分析

采用Excel 2010和DPS對數據進行統計分析，用Duncan新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 UV-B輻照處理特早熟柑橘采后果皮的色差

由圖1可知，不同輻照處理果皮色差隨貯藏時間變化。L值：輻照0 h和24 h貯藏0～10 d時均呈降低趨勢，分別下降0.40和0.94；貯藏10 d后，L值升高，分別增加1.09和1.21，0 h與24 h的L值差異不顯著。輻照48 h隨貯藏時間增加L值顯著升高，增加2.30；48 h的L值顯著高于0 h和24 h。a值：輻照0 h、24 h和48 h貯藏0～10 d時均顯著升高，分別增加15.77、12.63和13.22；貯藏10 d后各處理a值變化不明顯，保持在較為平穩階段。b值：0 h和24 h貯藏0～10 d時略有降低，分別降低0.18和0.44；貯藏10～30 d時分別增加2.64和0.52，差異均不顯著。輻照48 h的b值隨貯藏時間增加而升高，貯藏30 d時顯著增加5.27，且顯著高于0 h和24 h。綜合看，輻照0 h、24 h、48 h貯藏0～30 d，L值、a值、b值總體上隨貯藏時間增加而升高，其中，輻照48 h的L值、b值顯著高于0 h和24 h。

注：不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)，下同。

2.2 UV-B輻照處理特早熟柑橘采后果皮的色素

從圖2看出，葉綠素a：輻照0 h和48 h貯藏0～20 d時呈升高趨勢，分別增加0.86和0.33；貯藏20 d后呈降低趨勢，分別降低2.64和1.23。輻照24 h貯藏10 d時含量最高，為3.59，隨著貯藏時間增加呈降低趨勢，貯藏30 d時降至1.37。輻照24 h和48 h的葉綠素a含量與0 h呈顯著性差異，輻照24 h的葉綠素a含量與48 h差異不顯著。葉綠素b：輻照0 h貯藏0～20 d時無顯著差異，貯藏30 d后顯著降低。輻照24 h隨貯藏時間增加葉綠素b含量呈先升后降趨勢。輻照48 h貯藏0～10 d時葉綠素b含量呈降低趨勢，貯藏10～30 d時呈先升后降趨勢，且差異均不顯著。類胡蘿卜素：輻照0 h、24 h和48 h均隨貯藏時間增加類胡蘿卜素含量呈先升后降趨勢，均在20 d時達最大，分別為0.90、1.12和1.00；與0 d、10 d時差異顯著。綜上，輻照0 h、24 h、48 h的葉綠素a、葉綠素b含量隨貯藏時間增加呈降低趨勢，以輻照24 h和48 h處理最佳；輻照0 h、24 h和48 h的類胡蘿卜素含量隨貯藏時間增加均呈先升后降趨勢，在20 d時達最大。

圖2 UV-B輻照處理特早熟柑橘采后果皮的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量

2.3 UV-B輻照處理特早熟柑橘采后色素代謝基因的相對表達量

由圖3可知，不同UV-B輻照處理柑橘果皮中色素代謝基因的相對表達量存在差異。其中，葉綠素降解途徑的關鍵基因PaO和RCCR均呈升高趨勢，其相對表達量均依次為48 h>24 h>0 h。類胡蘿卜素合成途徑的關鍵基因PSY的相對表達量為48 h處理高于0 h和24 h處理。表明，采后UV-B輻照處理可促進特早熟柑橘貯藏期脫綠(葉綠素降解)，輻照48 h有利于貯藏期果皮類胡蘿卜素的累積，對提高色澤品質具有重要作用。

圖3 UV-B輻照處理特早熟柑橘采后色素代謝基因的相對表達量

3 討論

柑橘果皮顏色主要由果皮所含的葉綠素、類胡蘿卜素的種類和含量決定。其中，類胡蘿卜素是1種數量龐大的化合物家族，且類胡蘿卜素所賦予果實的顏色較綠色更受消費者青睞[12]。UV-B輻照處理后破壞葉綠體結構，而類胡蘿卜素作為一種植物光合作用的保護劑，可隨葉綠素降低而升高，從而對葉綠素起保護作用[13]。研究結果表明，UV-B輻照0 h、24 h和48 h貯藏0～30 d時特早熟柑橘果皮色差的L值、a值和b值總體隨貯藏時間增加而升高，其中，輻照48 h的L值、b值顯著高于0 h和24 h；果皮色素的葉綠素a和葉綠素b含量隨著貯藏時間增加而降低，但降幅均較0 h高；類胡蘿卜素含量隨貯藏時間增加而增加，且在貯藏20 d時達最大，與張文會等[14-15]的研究結果一致。根據果皮色素代謝基因的相對表達量，推斷UV-B輻照處理對貯藏期柑橘果皮葉綠素的降解具有促進作用，輻照48 h可有效促進貯藏期果皮中類胡蘿卜素的積累，輻照0 h和24 h的基因PSY的相對表達量差異不顯著，推測輻照24 h未達到促進果皮類胡蘿卜素積累的輻照劑量。綜合看，UV-B輻照對柑橘果實的色澤具有明顯促進作用。

4 結論

特早熟柑橘采后UV-B輻照劑量不同對果皮色澤的影響不同，輻照顯著提高果皮的明亮度和黃色度，降低葉綠素含量而提高類胡蘿卜素含量；提高PaO、RCCR和PSY基因的相對表達量，促進特早熟柑橘貯藏期脫綠(葉綠素降解)，輻照48 h有利于果皮貯藏期類胡蘿卜素的累積，對提高貯藏期的色澤品質具有重要作用。綜上，在果實貯藏期間適度增加UV-B輻照可有效改善特早熟柑橘果實的表皮色澤，以UV-B輻照48 h貯藏20 d最佳。