淡水養殖凡納濱對蝦生長相關基因HDAC1克隆及其表達分析

駱永麗，劉 紅*，于忠利，王文雁，戴習林

（1水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室（上海海洋大學），上海 201306；2水產科學國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306；3上海市奉賢區水產技術推廣站，上海 201400）

0 引言

【研究意義】凡納濱對蝦（Litopenaeus vanna‐mei）又稱南美白對蝦，養殖范圍廣、產量高，約占蝦類總產量的85%（唐揚等，2018；李強勇等，2020）。近年來，凡納濱對蝦淡水養殖已發展成為我國水產業的一種重要養殖方式，但針對其淡水養殖生長發育及基因調控的研究相對較少（陳田聰等，2018；方振朋等，2020）。乙?；亲钤绫谎芯康谋碛^遺傳修飾，組蛋白乙?；且阴；D移酶和去乙?；竻f同調控的一個動態過程，組蛋白去乙酰化對于真核基因表達調控具有重要意義（蒙娟等，2020；史建磊等，2020）。組蛋白去乙?；?（Histone deacety‐lase 1，HDAC1）是組蛋白去乙酰化酶復合物的重要組成部分，因此，克隆凡納濱對蝦HDAC1基因，并從分子水平探究不同家系凡納濱對蝦在淡水養殖過程中的生長性能，對揭示凡納濱對蝦生長基因調控機制及篩選優良品系具有重要意義。【前人研究進展】HDAC1基因參與調節早期胚胎的發育和細胞分化等生理過程（Brunmeir et al.，2009），目前有關脊椎動物的HDAC1基因研究較多。劉峰（2005）通過研究豬HDAC1基因與生長性狀相關的多態性位點，發現不同基因型對其生長和胴體性狀均有遺傳效應，其中HDAC1基因G等位基因具有顯著提高生長的效應。Montgomery等（2007）研究發現小鼠HDAC1基因缺失或C端突變均會導致胚胎發育遲緩，甚至在妊娠11 d前死亡，故推測HDAC1基因參與小鼠的胚胎發育過程。李明楊等（2017）研究證實，HDAC1基因可作為豬生長的一個主要候選基因，或在品種選育時作為分子標記。楊穎等（2018）在南陽黃牛HDAC1基因中挖掘出與生長相關的SNP位點，為南陽黃牛分子育種提供了新的分子標記。在水產領域，李慧等（2014）通過分析HDAC1基因在牙鲆（Paralichthys olivaceus）變態前及變態階段的表達情況，發現隨著仔魚的發育，HDAC1基因在冠狀幼鰭、腸道等多種器官中的表達強度逐漸增強，在鰓組織中的表達貫穿整個變態發育期，但在變態后期表達趨勢減弱，故推測HDAC1基因在牙鲆的生長過程中發揮重要作用。Ko等（2019）研究表明，在患有嚴重肝細胞丟失的斑馬魚中，HDAC1基因通過Sox9b基因調節肝祖細胞（LPC）向肝細胞分化，并通過Cdk8、Fbxw7和Notch3基因調節LPC向膽管上皮細胞（BEC）分化。此外，在軟體動物中也有HDAC1基因的相關報道。高曉艷等（2016）成功克隆獲得文蛤HDAC1基因，并在其外顯子區域發現3個與文蛤生長相關的SNP位點（627A>T、924T>C和1266T>C）；任付真等（2016）對泥蚶中HDAC1基因進行克隆及定量分析，發現其在多種組織中均有表達，且以足部的相對表達量最高，說明HDAC1基因對該組織生長具有重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】HDAC1基因與動物生長密切相關，近年來有關渦蟲（張振超等，2013）和果蠅（Wang et al.，2018）等物種HDAC1基因結構和功能的研究已有報道，但鮮見針對凡納濱對蝦的相關報道。【擬解決的關鍵問題】選取自選家系自交后代及其他3個家系開展淡水養殖試驗，分析HDAC1基因在不同淡水生長特性家系凡納濱對蝦中的表達情況，以明確HDAC1基因在對蝦淡水養殖過程中的功能作用，為揭示凡納濱對蝦生長調控的分子機制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于基因克隆及組織分布表達的凡納濱對蝦取自上海市金山區上海海洋大學基地，體長6~8 cm，體重3~4 g；解剖采集肝胰腺、胃、腦、腸道、鰓、眼柄、心臟和肌肉等組織，-80 ℃保存備用。用于淡水生長對比試驗的凡納濱對蝦則是從海南空運回上海的仔蝦，包括4個家系：自選家系自交后代（E4，關島雌蝦與關島雄蝦自交后代）及3個其他雜交后代（E1，厄瓜多爾野生雌蝦與引進雄蝦雜交后代；E2，厄瓜多爾野生雄蝦與引進雌蝦雜交后代；E3，關島雌蝦與厄瓜多爾野生雄蝦雜交后代），在上海市金山區上海海洋大學基地淡化養殖7 d后選擇體長規格一致的個體放入水泥池中養殖。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 采用Total RNA Extractor試劑盒（TaKaRa）提取凡納濱對蝦上述組織樣品的總RNA，以ND-2000核酸蛋白檢測儀檢測總RNA濃度和OD值，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。按SMARTer RACE 5'/3' Kit試劑盒（Taka‐Ra）說明反轉錄合成cDNA，-20 ℃保存備用。

1.2.2 凡納濱對蝦HADC1基因cDNA全長及內含子克隆 利用DNAMAN對本課題組前期研究獲得的凡納濱對蝦轉錄組中類似HDAC1基因的Unigenes與GenBank 預測的凡納濱對蝦HDAC1基因序列（XM_027358592.1）進行比對，基于保守區域設計引物（表1），以合成的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增。根據獲得的保守片段設計特異性引物5'-RACE和3'-RACE，擴增HDAC1基因RACE片段（圖1），最后用DNAMAN對測序結果進行拼接，以獲得HDAC1基因cDNA全長。利用NCBI在線工具預測HDAC1基因內含子，并根據HDAC1基因cDNA全長序列設計4對引物（表1）進行內含子序列克隆。所有引物均委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成，稀釋成10 μmol/L備用。PCR反應體系50.0 μL：2×TaqPCR Mix 25.0 μL，上、下游引物各2.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 18.0 μL。擴增程序：95 ℃變性5 min；95 ℃30 s，退火30 s，72 ℃延伸時間為1 kb/min；72 ℃終延伸10 min。退火溫度和延伸時間見表2。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，以瓊脂糖凝膠回收試劑盒［天根生物科技（北京）有限公司］進行膠回收，回收產物克隆至pMD19-T載體上，菌液直接送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表2 PCR擴增退火溫度及延伸時間Table 2 Annealing temperature and extension time of PCR amplification

圖1 凡納濱對蝦HDAC1基因RACE克隆示意圖Fig.1 RACE cloning diagram of HDAC1 gene in L.vannamei

表1 凡納濱對蝦HDAC1基因克隆及表達分析的擴增引物Table 1 Amplified primers for cloning and expression analysis of HDAC1 gene in L.vannamei

1.2.3 凡納濱對蝦HADC1基因序列分析 將PCR擴增產物測序結果去除接頭后拼接獲得cDNA全長，利用在線生物信息學分析軟件（表3）對凡納濱對蝦HDAC1基因序列及其編碼蛋白進行預測分析。

表3 生物信息學分析軟件Table 3 Bioinformatics analysis software

1.2.4 凡納濱對蝦HDAC1基因組織表達分析 采用SYBR Green ProTaqHS qPCR Kit（艾克瑞生物科技有限公司）進行實時熒光定量PCR檢測，以凡納濱對蝦18S rRNA為內參基因，設3次重復。實時熒光定量PCR反應體系20.0 μL：SYBR 10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板0.2 μL，ddH2O 9.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，進行40個循環。采用2?△△Ct法換算HDAC1基因相對表達量，并以SPSS 20.0進行單因素分析（One-way ANOVA），利用Excel 2016制圖。

1.2.5 生長對比試驗及HDAC1基因表達分析 4個家系凡納濱對蝦仔蝦在3.5 m×7.0 m的水泥池中養殖70 d。每個家系群體設3個重復，每個水泥池投放1300尾仔蝦。每日分別于7：00、13：00和18：00時準確稱量投喂飼料，投喂量為對蝦體重的5%~10%；24 h連續充氣增氧。從下池開始每隔10 d從每個水泥池中隨機取至少30尾蝦測量體長和體重，在養殖40、50和70 d時對4個家系群體的凡納濱對蝦進行解剖，采集腸道組織，并選擇養殖70 d時各家系群體中的大蝦（體長8~11 cm，體重6~12 g）和小蝦（體長5~8 cm，體重2~6 g），解剖采集其腸道組織，液氮速凍后-80 ℃保存，用于HDAC1基因表達分析。

養殖試驗結束后記錄各養殖池凡納濱對蝦的總攝食量（FI，g），并計算存活率（RS，%）、日增重率、體長日增率、特定生長率（SGR）及飼料轉化率（FCR）。計算公式如下：

式中：Nt、N0分別為試驗終末對蝦數量和試驗初始對蝦數量，Wt、W0分別為試驗終末對蝦平均體重和試驗初始對蝦平均體重，t為養殖天數，Lt、L0分別為試驗終末對蝦平均體長和試驗初始對蝦平均體長，FI為總攝食量。

2 結果與分析

2.1 凡納濱對蝦HDAC1基因cDNA全長測序結果

根據本課題組前期構建轉錄組數據中的HDAC1基因轉錄本，通過RACE克隆獲得4個基因片段，長度分別為700、1323、1625和385 bp（圖2），拼接后最終獲得HDAC1基因cDNA全長3230 bp，包括67 bp的5'非編碼區（5'-UTR）、1711 bp 的3'非編碼區（3'-UTR）及1452 bp的開放閱讀框（ORF），共編碼483個氨基酸殘基（圖3）。凡納濱對蝦HDAC1基因cDNA序列3'-UTR有加尾信號AATAAA和poly（A）尾。

圖2 凡納濱對蝦HDAC1基因RACE擴增電泳結果Fig.2 RACE amplification electrophoresis of HDAC1 gene in L.vannamei

使用ExPASy預測得知，HDAC1蛋白分子量為54640.22 Da，理論等電點（pI）為5.59，屬于穩定的親水性蛋白；InterPro預測結果表明，HDAC1蛋白具有1個Histone deacetylase 1結構域（28~317 aa）；HDAC1蛋白無跨膜結構，定位于細胞核、線粒體、溶酶體的百分比分別為60%、10%和10%，由此推測HDAC1蛋白主要位于細胞核中；使用SOPMA和SWISS-MODEL分別預測凡納濱對蝦HDAC1蛋白的二、三級結構，結果發現其二級結構（圖4）中α-螺旋占33.54%、β-轉角占7.45%、β-折疊占15.12%、無規則卷曲占43.89%，三級結構建模（圖5）也顯示凡納濱對蝦HDAC1蛋白主要由α-螺旋和無規則卷曲構成。同源模板與凡納濱對蝦HDAC1 氨基酸序列的相似性為84.92%，GMQE為0.69，QMEAN為-0.31，說明凡納濱對蝦HDAC1蛋白與模板蛋白匹配度較高。

圖4 凡納濱對蝦HDAC1蛋白二級結構預測結果Fig.4 Prediction of the secondary structure of the HDAC1 protein in L.vannamei

圖5 凡納濱對蝦HDAC1蛋白三級結構預測結果Fig.5 Prediction of the tertiary structure of the HDAC1 protein in L.vannamei

2.2 HDAC1氨基酸序列同源比對分析及系統發育進化樹構建

HDAC1氨基酸多序列比對分析結果顯示，凡納濱對蝦與斑節對蝦（Penaeus monodon）、大型溞（Daphnia magna）、按蚊（Anopheles albimanus）、果蠅（Drosophila melanogaster）、歐洲大扇貝（Pecten maximus）、小鼠（Mus musculus）、人類（Homo sapiens）的HDAC1氨基酸序列相似性分別為99.79%、88.26%、77.89%、72.28%、82.10%、77.89%和78.31%，說明HDAC1氨基酸序列在不同物種間具有高度保守性。利用MEGA X的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建凡納濱對蝦和其他物種的HDAC1氨基酸序列系統發育進化樹，結果（圖6）發現凡納濱對蝦與斑節對蝦的親緣關系最近，其次是大型溞。

圖6 基于HDAC1氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹Fig.6 Phylogenetic tree constructed based on similarity of HDAC1 amino acid sequence

2.3 凡納濱對蝦HDAC1基因DNA序列分析結果

通過RACE克隆獲得4個基因片段（圖7），長度分別是645、607、1082和492 bp，拼接后最終獲得凡納濱對蝦HDAC1基因DNA序列總長4692 bp，包含8個外顯子和7個內含子，與預測的HDAC1基因DNA序列結果相符，在內含子區僅有個別堿基不同，均符合內含子GT-AG剪接規則。最長的內含子長度為542 bp，其他內含子長度則在100~300 bp。

圖7 凡納濱對蝦HDAC1基因DNA序列RACE克隆示意圖及擴增產物電泳結果Fig.7 RACE cloning diagram and amplified product electrophoresis of DNA sequence of HDAC1 gene in L.vannamei

2.4 凡納濱對蝦HDAC1基因組織表達分析結果

采用實時熒光定量PCR檢測HDAC1基因在凡納濱對蝦不同組織中的表達情況，結果顯示，凡納濱對蝦HDAC1基因在腸道中的相對表達量最高（圖8），顯著高于在其他組織中的相對表達量（P<0.05，下同），凡納濱對蝦HDAC1基因在不同組織中的相對表達量排序為腸道>腦組織>眼柄>胃>心臟>鰓組織>肝胰腺>肌肉。

圖8 凡納濱對蝦HDAC1基因在不同組織中的相對表達量Fig.8 Relative expression of HDAC1 gene in different tissues of L.vannamei

2.5 凡納濱對蝦生長對比試驗及其腸道HDAC1基因表達差異

由表4可知，4個家系群體中以E3的終末體長、終末體重、日增重率、體長日增長率及特定生長率最低，均顯著低于其他3個家系，而飼料轉化率顯著高于其他3個家系；E4的生長效果最優，其終末體長、終末體重、日增重率、體長日增長率及特定生長率均顯著高于其他3個家系。4個家系群體凡納濱對蝦的生長性能排序為E4>E1>E2>E3。

表4 不同家系凡納濱對蝦淡水養殖70 d后的生長指標比較Table 4 Growth index comparison of different families of L.vannamei cultured in freshwater for 70 days

利用實時熒光定量PCR檢測HDAC1基因在不同家系凡納濱對蝦腸道中的表達情況，結果（圖9）顯示，養殖40 d時E4的體重最重，HDAC1基因在E4腸道中的相對表達量也最高，且顯著高于其他3個家系；養殖50 d時也是以E4的體重最重及腸道中HDAC1基因相對表達量最高，二者均顯著高于其他3個家系群體；至養殖70 d時，HDAC1基因在不同家系群體大蝦中的相對表達量高于對應家系群體中的小蝦。無論是大蝦還是小蝦，均以E3的體重最輕、E4的體重最重，腸道中的HDAC1基因相對表達量也表現為E3最低、E4最高，且2個家系群體的差異達顯著水平。

圖9 不同家系群體凡納濱對蝦的體重及腸道中HDAC1基因相對表達量差異Fig.9 Weight of L.vannamei and relative expression of HDAC1 gene in the intestinal of different family populations of L.vannamei

3 討論

凡納濱對蝦是我國對蝦養殖產業中的主要養殖種類之一，但自白斑綜合征（WSSV）在國內首次暴發以來，凡納濱對蝦養殖產業受到重創（張宗鋒，2012）。隨后，對蝦養殖業又受到對蝦桃拉綜合癥病毒（TSV）、傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHH‐NV）和高致病性副溶血弧菌等病原微生物的影響，致使我國對蝦的養殖產量大幅度下降（熊建華等，2011）。我國親蝦的來源嚴重依賴于從國外進口良種，對凡納濱對蝦后代的自主培育力度不夠，迫切需要解決對蝦種苗生產中存活率低、抗逆性差及生長周期長等關鍵問題（戴耀達等，2018）。目前，針對凡納濱對蝦淡水養殖的研究主要集中在養殖模式及疾病防控方面。樊慧敏等（2019）對凡納濱對蝦淡水養殖模式下甲殼潰瘍癥的致病原因及防控措施進行探究，發現氣單胞菌是甲殼潰瘍癥的主要致病因素，并提出利用菌毒克進行消毒、內服恩諾沙星及調控蝦池水質和蝦腸肝健康的防控措施。徐婷婷等（2019）對明光市潘集鎮利用女山湖水土塘成功養殖凡納濱對蝦的技術進行總結，為內陸水域凡納濱對蝦養殖提供了參考。Fan等（2019）通過對比分析淡水和海水養殖環境中凡納濱對蝦腸道和沉積物的微生物群落結構，發現對蝦腸道和沉積物中的細菌組成基本相同，但細菌群落相對豐度存在明顯差異。為選育出能替代進口種蝦，且適應上海養殖氣候和淡水養殖條件下能快速生長的凡納濱對蝦群體，本研究對4個家系群體進行70 d的淡水（鹽度1‰）養殖試驗，結果顯示E4具有較優的生長性能，而E1（厄瓜多爾野生雄蝦與引進雌蝦雜交后代）和E2（引進雄蝦與厄瓜多爾野生雌蝦雜交后代）的生長性能相近，可能是由于E1和E2為相同2個群體正反雜交的后代。

Kelly等（2013）通過將HDACs與酵母蛋白Rpd3進行同源比對分析，可分為四大類共18個亞型，目前研究較多的是I類的HDAC1基因。本研究克隆獲得凡納濱對蝦HDAC1基因cDNA序列全長3230 bp，共編碼483個氨基酸殘基，與NCBI上預測的序列相比多出13個氨基酸殘基。凡納濱對蝦HDAC1蛋白具有1個保守結構域，推測該結構域在調控組蛋白去乙?；^程中發揮關鍵作用。Qiu等（2006）研究發現，HDAC1有6個賴氨酸殘基發生乙?；?，其中，2個賴氨酸的乙?；↘218和K220）位于催化核心結構域附近，其他4個賴氨酸（K432、K438、K439和K441）位于C端區域。C端區域的缺失極大降低去乙酰化酶活性，因此該區域被認為是調控域。組蛋白去乙?；富钚越档椭饕峭ㄟ^HDAC1乙酰化減弱其活性，并通過與HDAC1的二聚化反式抑制HDAC2活性（Kim et al.，2020）。HDAC1活性還可通過磷酸化進行調節，HDAC1被酪蛋白激酶II磷酸化的同時被絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-3（MKP-3）去磷酸化。這些位點的磷酸化對于組蛋白去乙酰化酶活性及HDAC1與輔抑制物復合物相互作用至關重要，磷酸酶處理并未顯著影響體內的HDAC1活性。HDAC1磷酸化在G1階段增加，在S/G2后期則顯著降低（Kim et al.，2020），但目前尚未明確磷酸化的增加是否與細胞周期中HDAC1水平的增加有關，其他次要位點的磷酸化是否影響HDAC1功能也有待進一步闡明。凡納濱對蝦HDAC1蛋白三級結構中β-折疊處于平行排列，可能具有維持蛋白結構穩定的作用（張寧，2010）。

目前，已通過高通量測序技術獲得凡納濱對蝦基因組序列，且分析發現內含子占基因組序列的絕大部分，但針對非編碼區內含子序列及其功能的研究較少。本研究結果表明，HDAC1基因在凡納濱對蝦各組織中均有表達，且以腸道中的相對表達量最高，表明該基因可能參與凡納濱對蝦腸上皮細胞的分化過程。Tou等（2004）對哺乳動物HDAC1基因在控制器官發生過程中腸上皮分化中的作用進行研究，結果發現HDAC1基因參與調節哺乳動物腸上皮細胞分化。HDAC1基因在凡納濱對蝦腦組織中的相對表達量也較高，與HDAC1基因在果蠅（Das and Bhadra，2020）、斑馬魚（Kiyooka et al.，2020）的中樞神經系統及大腦發育過程中高表達的結論一致。此外，Lu等（2017）研究表明心臟中的HDAC1基因能促使骨髓間充質干細胞定向分化為心肌細胞；Kim等（2017）、陸穎等（2020）在哺乳動物和斑馬魚中發現HDAC1基因調節視網膜的發育。本研究結果顯示，HDAC1基因在凡納濱對蝦心臟中也有較高的表達水平，故推測該基因在促進凡納濱對蝦生長發育方面發揮重要作用。

本研究是依據4個家系群體凡納濱對蝦的生長狀態進行采樣，以檢驗各時間點不同家系群體凡納濱對蝦在體長和體重方面是否存在顯著差異。在養殖60 d時，4個家系群體的體長、體重顯著差異分析結果與養殖40 d時的分析結果一致，而在養殖40、50和70 d時，4個家系群體凡納濱對蝦的體長、體重顯著差異分析結果并不一致，因此只選擇養殖40、50和70 d的4個家系群體凡納濱對蝦進行HDAC1基因表達分析。為進一步探究HDAC1基因是否參與凡納濱對蝦的生長過程，于養殖70 d時通過實時熒光定量PCR檢測分析各家系群體中小蝦、大蝦腸道的HDAC1基因相對表達量，結果顯示無論是大蝦還是小蝦，生長慢的群體中HDAC1基因相對表達量較低，生長快的群體中HDAC1基因相對表達量較高，即HDAC1基因相對表達量與凡納濱對蝦的生長速度成正比。

4 結論

凡納濱對蝦HDAC1基因在各組織中均有表達，以腸道中的相對表達量最高，且HDAC1基因相對表達量與凡納濱對蝦的生長速度成正比，故推測其參與凡納濱對蝦的生長調節過程。