肌萎縮側索硬化致病的分子遺傳學機制

馬金，豐宏林

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院神經內科，哈爾濱 150001)

肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種選擇性累及上、下運動神經元的致命性神經系統變性疾病[1]，主要累及錐體束、腦干和脊髓前角細胞，臨床表現為進行性加重的肌肉萎縮、無力、痙攣以及認知損害等，通常中年以后發病，表現為持續性、進行性肌肉萎縮和無力，多數患者因呼吸機麻痹在發病后2～4年死亡[2]。全球ALS的發病率逐漸升高，該病不僅給患者帶來巨大痛苦，而且給患者家庭及社會造成了沉重負擔。由于ALS致病機制尚未明確，因此有效治療措施的研究也進展緩慢。研究顯示，基因突變參與ALS的發病，并與疾病進展密切相關[3]。但很多導致或使人易患ALS的基因及其變異仍然未知，因而尚不能完全明確ALS的具體發病機制，這也給疾病的治療和新藥研發帶來較大挑戰。現就與ALS發病及進展相關的基因及其潛在的分子遺傳學機制進行綜述，擬為ALS更深入的致病機制研究及致病基因發現提供參考，亦為相關新藥的作用靶點及診斷標志物的開發與利用提供依據。

1 ALS相關致病基因

ALS是運動神經元退變性疾病，其中10%為常染色體顯性遺傳，呈家族性分布，其余約90%是散發性ALS，家族性ALS的部分遺傳基因也存在于散發 ALS中[3-4]。隨著分子遺傳技術在ALS研究中的應用，發現40%～55%的ALS由已知的ALS相關基因變異引起，目前已發現的與ALS發病相關的基因約有50個[3,5]，見表1，其中最常見的為超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)突變(20%)、C9orf72(chromosome 9 open reading frame 72)重復擴增(40%)、肉瘤融合蛋白(fused in sarcoma，FUS)(1%～5%)和交互反應DNA結合蛋白-43(transactive response DNA binding protein-43，TDP-43)(1%～5%)[6-7]。人種不同，致病基因的變異亦不同，其中歐洲人以C9orf72突變為主，占33.7%，其余依次為SOD1(14.8%)、TDP-43(4.2%)、FUS(2.8%)；亞洲人以SOD1突變為主(30%)，其余依次為FUS(6.4%)、C9orf72(2.3%)、TDP-43(1.5%)[5]。中國人群中ALS相關致病基因總體突變率在家族性ALS中為55.0%，在散發性ALS中為11.7%，其中SOD1基因突變頻率最高(25.6%)，其次為FUS(5.8%)、TDP-43(5.8%)、DCTN1(Dynactin 1)(3.6%)以及C9orf72(3.5%)[8]。ALS的發病可能與氧化應激、線粒體功能障礙、興奮性氨基酸毒性、內質網應激、軸突運輸障礙、RNA代謝紊亂、神經炎癥及膠質細胞病變等有關，這些致病機制與ALS相關致病基因變異密切相關[3]。

表1 與ASL發病相關的基因、基因位點以及表達的蛋白質

2 ALS致病的分子遺傳學機制

2.1SOD1 在ALS相關致病基因中，SOD1是報道最多且研究最為深入的基因。SOD1基因與ALS具有關聯性，其編碼一種含有153個氨基酸的金屬酶[9]。SOD1二聚體存在于細胞質、細胞外部空間及線粒體外膜，通過將細胞呼吸過程中產生的超氧陰離子自由基歧化為O2和H2O2，而起到保護細胞免受活性氧損害，保持細胞內活性氧化物內穩態的作用[2]。目前研究已報道超過180種與ALS相關的SOD1基因變異，這些基因變異與疾病病程、表型及嚴重程度相關[10]，如發生A4V、H43R、L84V、G85R N86S和G93A變異者疾病進展迅速，患者生存時間短；而發生G93C、D90A或H46R變異者通常壽命較長[11]。SOD1基因特定變異者在ALS中表現出不同的臨床特征，如A4V變異與四肢發作的侵襲性ALS相關，D90A純合子患者通常表現為緩慢進展的輕癱，而雜合子D90A變異與延髓、上肢和下肢等運動相關區域功能障礙相關，且進展較快[12]。

SOD1基因突變致使SOD1的構象和功能發生改變，從而導致ALS。研究指出，SOD1基因變異與多種蛋白質的作用相關，包括興奮性毒性、活性氧上調引起的氧化應激、內質網應激、線粒體功能障礙等[13]。SOD1基因突變體改變機體的氧化活性，可導致有毒的羥自由基累積，破壞蛋白質折疊并損害運動神經元的軸突運輸[14]。此外，SOD1基因突變體可誘導內質網應激，導致未折疊蛋白反應和內質網相關降解激活，內質網的相關降解可破壞細胞穩態，促進細胞凋亡，引起運動神經元的損傷[7]。SOD1突變可引起軸突運輸損害，錯誤折疊的SOD1不能通過線粒體膜運輸，而是在線粒體外膜積累，從而觸發線粒體依賴的細胞凋亡程序，引起運動神經元凋亡[15]。亦有研究顯示，野生型SOD1蛋白的錯誤折疊是導致ALS病情進展的重要因素[16]。

目前對于SOD1變異產生興奮毒性的形式尚存在爭議，爭議主要集中在SOD1蛋白是可溶性形式還是聚集性形式?？扇苄許OD1蛋白可在細胞核及細胞質中穿梭，隨著可溶性SOD1蛋白累積的增加，細胞對抗應激刺激的生理防御增加，從而抑制超氧陰離子增加引起的DNA損傷[17]。研究顯示，細胞核中可溶性SOD1水平越高，ALS的病程持續時間越長，兩者呈正相關，表明可溶性SOD1蛋白在核室中可能具有運動神經元保護作用[17]。也有學者發現，突變或外界因素導致SOD1聚集性形式增加可導致細胞毒性增加，聚集性SOD1累積產生的毒性可破壞細胞通路，導致線粒體功能障礙、興奮性毒性、氧化應激、內質網應激、軸突運輸中斷和細胞間朊病毒樣增殖[10,13-17]，提示累積產生的毒性可能在ALS的發病中起重要作用。以上發現強調以減少聚集性SOD1為目標治療ALS的潛在好處。

2.2TARTDP-TDP-43 TARTDP基因編碼TDP-43[18]，其是人體內廣泛存在的一類DNA轉錄抑制因子。TARTDP在脊髓運動神經元中的主要功能是通過與低分子量微絲信使RNA(message RNA，mRNA)結合，進而影響微絲與細胞支架的形成[18]。TDP-43是由414個氨基酸組成的DNA/RNA結合蛋白，通常在細胞核與細胞質之間穿梭，是導致ALS患者蛋白聚集的主要因素[19]。迄今為止，在不同種族中發現了40多個TARDBP變異體，大部分變異是位于轉錄本C端富含甘氨酸區域的錯義變異[18]。研究顯示，在無TARDBP基因變異的散發病例和C9ORF72變異者的腦和脊髓中泛素陽性包涵體中存在TDP-43的聚集[19-20]。TDP-43聚集成團，導致RNA代謝的正常功能喪失，進而導致腦細胞死亡或脊髓細胞神經毒性[21]，表明TDP-43基因變異是導致ALS和神經退行性變的主要原因。

TDP-43的致病機制比較復雜。TDP-43作為基因表達的調節因子參與RNA加工，包括前mRNA剪接、mRNA穩定性調控、mRNA轉運、翻譯以及非編碼RNA調控[22-23]。TDP-43與前mRNA的3′非翻譯區結合，通過反饋機制自我調節：當TDP-43過剩時，mRNA轉錄產物被降解而不是被翻譯，致使細胞功能障礙；當TDP-43減少或耗盡時，mRNA代謝廣泛失調[19]。TDP-43在轉錄翻譯中的乙?；?、泛素化、磷酸化、蛋白水解及二硫鍵形成等亦被認為是ALS的潛在致病因素[24-25]。再者，細胞質中TDP-43上調形成的包涵體在細胞間傳播，進而損傷神經元，導致ALS患者的運動神經元死亡和神經退行性病變[26-27]。此外，有研究報道細胞核中TDP-43的減少會抑制運動神經元軸突的再生，運動神經元中TARDBP/TDP-43的上調通過改變RNA的剪接和穩定性增加ALS的發生風險；同時TARDBP/TDP-43缺失通過下調骨骼肌中TBC1D1(TBC1 domain family member 1)蛋白導致年齡依賴性腦萎縮，進而導致神經元功能受損[7,27]。

2.3FUS FUS基因編碼由526個氨基酸組成的多功能蛋白，屬于家族性特發性震顫RNA結合蛋白，2009年發現FUS基因與ALS相關，主要參與基因轉錄和表達的調控[28-29]。FUS基因突變多呈常染色體顯性遺傳，與早發型和青少年ALS有關[30-31]。目前發現的與ALS相關的FUS突變超過50種[2]。在正常生理條件下，FUS主要定位于細胞核，穿過細胞質參與核質的運輸，通過前mRNA剪接、RNA轉運和翻譯在基因表達中發揮作用，FUS亦參與DNA修復，包括DNA雙鏈斷裂修復中的同源重組和非同源端連接，并在細胞的副斑點形成中發揮防御作用[23,32-33]。因此，突變的FUS會破壞核質運輸，致使細胞核耗盡，而FUS在細胞質中聚集可導致神經毒性[34]。FUS突變不僅抑制了蛋白質的整體翻譯，也抑制了蛋白質的局部翻譯，使樹突和軸突的終末受損；同時FUS突變也會導致突觸穩態缺陷和功能障礙，突觸穩態維持所需蛋白的減少也可能導致ALS[35]。

運動神經退行性病變與細胞中可溶性FUS聚集直接引起的毒性相關[36]。家族性ALS中有約5%的患者會出現融合在FUS中的RNA結合蛋白突變，在這些患者中可觀察到FUS陽性細胞質包涵體[33]。進一步的動物實驗表明，體內FUS與RNA的相互作用可增加FUS在神經元細胞質中的聚集，加重疾病的嚴重程度[37]。此外，FUS變異是導致細胞功能受損而致病的直接因素，其會導致RNA剪接缺陷、DNA破壞及FUS的不能自動調節[33,38-39]。研究亦表明，FUS基因突變導致的病理性折疊蛋白可引發朊毒體的形成，導致神經退行性病變，如ALS[40]。需要特別關注的是，FUS相關ALS的致病機制是細胞核內FUS生理功能的喪失，而不是細胞質FUS聚集毒性的喪失[7]。

2.4C9orf72 C9orf72首先在歐洲人群中發現，是基因非編碼區六核酸[(GGGGCC)n]重復擴增序列，其在亞洲人群中并不常見[2]。研究顯示，C9orf72在ALS患者中反復擴增，mRNA和蛋白水平下降，進而導致與疾病相關的蛋白缺失[41-42]。研究顯示，重復序列的G堿基增加會使轉錄中易形成G四倍體二級結構，從而引發一系列蛋白質的異常相互作用[41]。對ALS中與C9orf72相關通路的研究顯示，RNA的錯誤處理是關鍵。首先，改變了對擴增的轉錄堿基本身的處理：C9orf72轉錄堿基包含兩個交替使用的第一外顯子(1a和1b)，重復擴增存在于它們之間的內含子中。轉錄產物產生的各種異構體包含一個或兩個外顯子，其存在有利于1a外顯子轉錄的重復擴增。這導致含有重復擴增的轉錄產物比例增加，影響內含子重復轉錄的RNA處理，如轉錄失敗、內含子重復剪接減少和核聚集[43-44]。其次，部分含有重復轉錄的堿基受到非血管緊張素原的RNA翻譯，導致異常的雙肽重復蛋白產生，進而在中樞神經系統形成神經包涵體，并可能參與疾病的發生[45]。再次，擴增的重復序列會對RNA加工產生影響。大部分C9orf72-ALS患者中發現了含有重復擴增的RNA，這些RNA位點能夠與各種RNA結合蛋白發生異常相互作用，進而對RNA的表達和剪接產生影響，從而產生毒性[20,46]。

C9orf72的致病機制復雜多樣，除上述蛋白丟失理論及對RNA的影響外，C9orf72還可通過誘導運動神經元中甘氨酸-精氨酸重復蛋白表達，增加DNA損傷、氧化應激及線粒體功能障礙[47]；C9orf72突變可影響泛素-蛋白酶體系統，進而誘導運動神經元死亡[48]；C9orf72變異可通過激活α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸受體，致使運動神經元通過影響神經膠質細胞對谷氨酸的攝取，使谷氨酸興奮性增加，從而導致運動神經元的損傷甚至死亡[49]。

2.5其他基因變異 隨著基因測序技術的發展，大量與ALS相關的基因被發現，這些變異主要影響RNA穩態與轉運、蛋白質穩態和細胞骨架動力學。這些基因變異雖然罕見，但也為ALS的致病機制研究提供了一些線索，其中與RNA加工相關的基因有血管生成素、SETX、基質蛋白3、共濟失調基因2型、TAF-15、EWSR1、異質核核糖核蛋白A1、不均一核糖核蛋白、延長復合體蛋白3，與蛋白質運輸和降解相關的基因有鳥嘌呤核苷酸交換因子2、囊泡相關膜蛋白相關蛋白B/C、CHMP2B、FIG4、UBQLN2、SQSTM1、SIGMAR1、視神經蛋白、纈絡胺酸蛋白質、TANK結合激酶1，與細胞骨架和軸突動力學相關的基因有DCTN1、前纖維蛋白1、SPG11、TUBA4A、NEFH、外周蛋白、NEK1，與線粒體相關的基因CHCHD10等[7]?；蜃儺愑绊慉LS的表型及易感性。Diekstra等[50]研究顯示，UNC13A基因突變與ALS的易感性及患者生存期相關。共濟失調基因1和共濟失調基因2的三核苷酸重復擴增會增加患病風險[51-52]。Uyan等[53]研究顯示，EPHA3基因的變異表達與ALS發生呈負相關，被認為是ALS的潛在保護因素。綜上，ALS的發病與基因變異或遺傳背景有密切關系。

最近發現了一系列與ALS相關的基因。DNAJC7編碼熱激蛋白70，其在蛋白折疊、穩定等功能中發揮關鍵作用，可導致ALS模型中蛋白聚集[54]。WDR7的最后一個內含子可能與ALS有關，其擴增可導致RNA聚集[55]。酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員5是一個作用于神經A1星形膠質細胞的基因，可誘導A1星形膠質細胞產生神經毒性，導致運動神經元死亡和ALS進展，?；o酶A合成酶長鏈家族成員5在ALS中的表達上調，其過表達與人類體重快速減輕有關[56]。Sigma-1受體可調節線粒體呼吸，控制細胞對內質網和氧化應激的防御，Sigma-1受體的過表達具有神經毒性，導致線粒體功能障礙，在ALS致病中發揮作用[57]。GLT8D1也被認為是ALS的致病基因，其是糖基轉移酶8家族的一員，參與催化糖基的轉移。GLT8D1突變可抑制糖基轉移酶的正?；钚?，并對神經節苷脂信號轉導產生負面影響，該基因的變異與ALS患者的疾病嚴重程度和細胞毒性呈正相關[58]。KIF5A是一個與ALS相關的新基因，KIF5A突變可影響ALS患者的發病年齡、存活時間，KIF5A的變異破壞了軸突運輸，導致突觸中淀粉樣前體蛋白缺失，從而導致神經退行性病變[59]。雖然上述基因已被證實是ALS致病基因，但研究仍然有限，尚不完全清楚這些基因在ASL中的詳細作用機制。

3 小 結

自發現SOD1突變與ALS致病相關以來，ALS致病的分子遺傳學機制已經取得一系列進展。但由于ALS的病因病機十分復雜，除遺傳外，與生活習慣(活動及勞動強度等)、環境(紫外線、特殊物質接觸史)等也密切相關，因此目前難以對ALS的發病機制做出全面的詮釋。對新的致病基因、基因修飾及其分子途徑的研究可能會提高人們對ALS的認識。此外，對ALS致病基因間潛在的相互作用進行研究有助于其靶向治療。目前針對ALS提出了為單個患者提供個性化反義寡核苷酸治療的治療理念，在此基礎上，為ALS的常見致病途徑尋找靶點藥物已成為未來研究的重要方向，而個體化多靶點的干預治療較單靶點標準化治療可能更使患者受益。