一測多評法測定混合核苷片中核糖核苷含量

李嬋，溫錦榮，劉昭，張國榮，王震△

（1.陜西省藥品和疫苗檢查中心，陜西 西安 710065；2.西安萬隆制藥股份有限公司，陜西 西安 710119）

混合核苷為核糖核酸經麥芽根浸提液在酸性條件下進行酶解所得產物與玉米淀粉的混合物，含胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷等多種核苷。混合核苷片是以混合核苷為主藥制成的片劑，臨床用于急慢性肝炎、肝損傷及肝硬化的輔助治療，也可用于因輻射及放射治療或化學治療引起的白細胞減少癥和非特異性血小板減少癥或白細胞減少癥［1-2］。現行國家藥品標準中采用紫外-可見分光光度法控制制劑中核苷混合物的總量［3］，但檢測范圍廣，在該波長處有吸收的物質均可被檢出。在原標準基礎上建立高效液相色譜法［4-8］，采用一測多評法實現多成分的質量控制，同時解決對照品不易獲得的情況，選定合適的內參物，根據制劑各成分間存在的線性或比例關系，建立內參物與其他成分間的相對校正因子［9-14］，只需測定內參物的含量，通過校正因子計算其他成分的含量。為此，本研究中建立了鳥嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷與內參物腺嘌呤核苷的相對校正因子，通過外標法測定腺嘌呤核苷的含量，根據腺嘌呤核苷與其他成分間的相對校正因子計算胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷的含量，并與外標法測定的4種核糖核苷含量結果進行比較。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-2030C Plus型高效液相色譜儀、島津LC-2010CHT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；TDL-40B型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；MS105DU 型電子天平（梅特勒-托利多儀器<上海>有限公司，精度為0.1 mg）；CP225D 型電子天平（賽多利斯科學儀器<北京>有限公司，精度為0.1 mg）。

1.2 試藥

腺苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110879-201703，純度為99.7%）；鳥苷對照品（批號為T277G005，標定純度為0.3%），胞苷對照品（批號為R088G005，標定純度為99.4%），均購自德國CNW Technologies GmbH 公司；尿苷對照品（Sigma -Aldrich公司，批號為BCCC2099，標定純度為100.0%）；混合核苷片（西安萬隆制藥股份有限公司，國藥準字H20057365，批號分別為181206，181207，181208，181209，181210，181211，200902，201001，201002，201003）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：迪馬Platisil ODS 柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動相：30%甲醇（A）-5%甲醇（B），梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。在此色譜條件下混合對照品溶液胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷保留時間的RSD分別為0.03%，0.08%，0.11%，0.05%，峰面積的RSD分別為0.06%，0.05%，0.09%，0.19%。4 種核苷保留時間的RSD均小于1.0%，峰面積的RSD均小于2.0%，表明系統適用性試驗結果符合要求。胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的理論板數分別為8 192，10 698，15 208，144 254；分離度分別為7.128，19.965，26.910。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution procedure of the mobile phase（%）

2.2 溶液制備

供試品溶液：取樣品20片，研細，取細粉適量（約相當于核苷混合物0.16 g），精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加水適量，超聲處理10 min 使提取完全，用水稀釋并定容，搖勻，離心（轉速為3 500 r/ min）10 min，精密量取上清液5.0 mL，置50 mL容量瓶中，用水釋，搖勻并定容，0.45μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

混合對照品溶液：取胞嘧啶核苷對照品15 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水使溶解并定容，搖勻，作為胞嘧啶核苷對照品母液（質量濃度為0.15 mg/mL）。分別取尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷對照品11.5 mg，精密稱定，分別置25 mL 容量瓶中，加水使溶解并定容，搖勻，作為尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷對照品母液（質量濃度均為0.46 mg/mL）。分別精密量取上述4 種核苷對照品母液各1.0 mL，置50 mL 容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，即得。

陰性對照品溶液：按處方比例制備不含混合核苷的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備相應的陰性對照品溶液。

對照品定位溶液：精密量取上述4種核苷對照品母液各1.0 mL，分別置50 mL容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，即得。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2 項下陰性對照品溶液、對照品定位溶液、混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，結果各成分與相鄰組分分離較好。色譜圖見圖1。

線性關系考察、檢測限與定量限確定：分別精密量取2.2 項下核苷對照品母液1.0 mL，置25 mL 容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，作為線性溶液6；分別精密量取上述溶液1，2，3，5，8 mL，置10 mL 容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，分別作為線性溶液1-5。按2.1項下色譜條件進樣測定，以胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，詳見表2。取2.2項下對照品溶液，逐級稀釋，以信噪比分別為10∶1和3∶1 的質量濃度計算定量限和檢測限。按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果見表2。

表2 線性關系考察、定量限與檢測限確定結果Tab.2 Results of the linear relation test，LOQ and LOD

重復性試驗：取樣品（批號為201001）適量，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄各成分的峰面積，計算得胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的平均含量分別為2.30%，6.03%，6.62%，9.10%，RSD分別為1.40%，0.63%，0.88%，0.44%（n=5），表明方法重復性良好。

精密度試驗：取重復性試驗項下供試品溶液6份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄各成分的峰面積，計算胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的含量，平均含量分別為2.28%，6.12%，6.58%，9.01%，RSD分別為1.80%，1.60%，0.92%，1.10%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取重復性試驗項下供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別于0，2，5，9，12 h 時進樣測定，記錄各成分的峰面積，計算胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷峰面積的RSD分別為1.6%，0.58%，0.79%，0.50%（n=5），表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取胞嘧啶核苷對照品30 mg、鳥嘌呤核苷對照品75 mg、尿嘧啶核苷對照品75 mg、腺嘌呤核苷對照品115 mg，精密稱定，分別置100 mL容量瓶中，加水溶解、稀釋并定容，搖勻，作為各個成分的回收率對照品母液。取樣品（批號為201001）細粉適量（約相當于核苷混合物0.08 g），精密稱定，分別加入上述回收率對照品母液4，5，6 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液。按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄各成分的峰面積。計算得胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的回收率分別為99.4%，99.1%，100.5%，99.9%，RSD分別為0.83%、0.28%，0.81%，0.63%（n=9），表明結果準確度良好。

耐用性試驗：取2.2項下混合對照品溶液與供試品溶液，按2.1 項下色譜條件采用不同色譜儀、色譜柱進行檢測，記錄各成分的峰面積，按外標法以峰面積計算胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的標示含量。與2.1 項下色譜條件比較，不同色譜儀和色譜柱所得胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的標示含量的變化率分別為1.20%，0.25%，1.50%，0.23%，4 種成分標示含量總和的變化率為0.83%，均小于2.0%，表明方法耐用性良好。

2.4 相對校正因子（fs/i）

fs/i的建立：根據公式fs/i=（As×Ci）/（Ai×Cs）計算一測多評的fs/i［14］。式中，As代表內參物腺嘌呤核苷峰面積，Cs代表內參物腺嘌呤核苷質量濃度，Ai代表其他組分峰面積，Ci代表其他組分濃度。以腺嘌呤核苷為內參物，計算腺嘌呤核苷與胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷的fs/i分別為1.84，1.40，1.25，RSD分別為0.22%，1.75%，0.41%。結果見表3。

表3 胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷與腺嘌呤核苷的相對校正因子Tab.3 RCFs of cytidine，uridine and guanosine relative to adenosine

不同高效液相色譜系統和色譜柱對fs/i的影響：分別用Waters 2695、島津LC -2030C Plus 2 種高效液相色譜系統進行試驗，考察了迪馬Platisil ODS 色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和InertsilTMODS -3 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）對fs/i的影響，各成分在不同色譜系統和不同色譜柱上fs/i的RSD均小于5.0%［15］。詳見表4。

表4 不同色譜儀和色譜柱對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different chromatographs and chromatographic columns on the RCFs

2.5 一測多評法與外標法測定結果比較

取10 批樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，測定各成分的峰面積。以腺嘌呤核苷為內參物，計算腺嘌呤核苷與其他3種成分的fs/i，并通過fs/i計算各自的標示含量。以外標法計算4 種成分的標示含量，并對比2 種方法所測得結果的差異。結果見表5。外標法與一測多評法所測得結果的RSD均小于5.0%，差異無顯著性，表明一測多評法可用于混合核苷片中多種成分含量的測定。

表5 外標法與一測多評法測定結果比較（%）Tab.5 Comparison of content determination of four components in Mixed Nucleoside Tablets by the ESM and the QAMS（%）

3 討論

混合核苷片中主要有效成分為胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷等，其中腺嘌呤核苷對照品易得，性質較穩定。故選擇腺嘌呤核苷為內參物。混合核苷片中鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷均易溶于水。水作提取溶劑具有干擾小、不污染環境等優點［16］。故選擇水提法。本研究中，供試品溶液于200～400 nm 波長范圍進行紫外掃描，于257.8 nm 波長處有最大紫外吸收，且空白輔料溶液在此范圍內無紫外吸收。參考現行國家標準中含量測定方法，選擇260 nm作為最終吸收波長。

綜上所述，一測多評法可用于測定混合核苷片中多種成分的含量，可為其質量標準的研究提供參考。