馬爾尼菲籃狀菌分泌蛋白的鑒定及功能預測分析

韋吳迪，王 剛，何錦豪，羅 強，賴菁貞,3，蔣俊俊，葉 力，梁 浩

馬爾尼菲籃狀菌病(Talaromycosis)是一種區域高發性機會性感染性疾病，是我國華南地區AIDS人群死亡的重要原因[1]。該病發病隱秘，臨床治療后死亡率依舊高達30%，且復發率高，因此該病的致病病原體——馬爾尼菲籃狀菌(Talaromycesmarneffei, TM)，已被世界衛生組織列入真菌“關鍵病原體”清單中[2-3]。造成此現象的原因在于TM存在一套免疫逃避策略，而這很可能是通過自身分泌蛋白介導的。研究表明，毒力因子Mp1p蛋白可以抑制宿主巨噬細胞的炎癥反應，發揮免疫逃逸作用[4-5]。因此，深入分析TM分泌蛋白意義重大。然而，目前TM分泌蛋白還沒有得到系統地鑒定，僅停留在基于基因組的預測層面。

近年來，基于質譜技術的分泌蛋白組學在病原體毒力蛋白鑒定方面得到廣泛應用[6-9]。因此，本研究采用質譜技術對TM分泌蛋白進行系統全面的鑒定，結合生物信息學手段對TM分泌蛋白的生物學功能進行分析，為后續TM免疫逃逸相關研究以及TM病的治療提供科學依據和潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 TM菌株的來源與培養 TM菌株(ATCC18224)購自美國ATCC菌種保藏管理中心。TM接種于馬鈴薯斜面培養基(PDA)，28 ℃恒溫培養14 d，用PBS反復沖洗培養基表面，收集孢子懸液，玻璃棉濾掉真菌絲，獲得孢子濾液，14 000 g離心10 min，棄上清，PBS 洗兩次。分別取108的TM孢子，放入20 mL PDA液體培養基擴大培養5 d(兩重復)，取上清液進行以下實驗。

1.2 主要試劑和儀器 實驗中使用的主要試劑包括：二硫蘇糖醇(DTT，Sigma/D9163-25G)、尿素(國藥/10023218)、質譜級胰酶(Promega/V5280)、碳酸氫銨(Sigma/5330050050)、LC-MS 級乙腈(Thermo Fisher Chemical/A955-4)、LC-MS級甲酸(Thermo Fisher Scientific/A117-50)、丙酮(北京化工廠/11241203810051)。主要儀器包括：EASY-nLCTM 1200 納升級UHPLC(Thermo Fisher/LC140)、Q ExactiveTM HF-X 質譜儀(Thermo)、電泳儀(Bio-Rad)、酶標儀(Thermo/Multiskan FC)。

1.3 總蛋白提取 每組取20 mL TM培養上清液至超濾管中，14 000 g 離心15 min，丟棄穿透液。將超濾后的樣本重新置于1.5 mL離心管中，加入DB溶液(8 mol/L尿素、100 mmol/L TEAB，pH8.5)用于平衡蛋白溶液，再加入濃度10 mmol/L DTT 于56 ℃反應1 h，之后加入足量IAM，于室溫避光反應1 h[10-12]。

1.4 蛋白酶解 取蛋白樣品，加入DB 蛋白溶解液補足體積至100 μL，加入胰酶和100 mmol/L TEAB 緩沖液，混勻后于37 ℃酶切4 h，再加入胰酶和CaCl2酶切過夜。加入甲酸調節pH 小于3，混勻后于室溫、12 000 g 離心5 min，取上清緩慢通過C18 除鹽柱，之后使用清洗液連續清洗3 次，再加入適量洗脫液，收集濾液，凍干。

1.5 質譜檢測 配制流動相A 液(100%水、0.1%甲酸)和B 液(80%乙腈、0.1%甲酸)。使用 A 液溶解1 μg樣品進樣(0.1 mg/mL)，液質檢測。使用EASY-nLCTM 1200 納升級UHPLC 系統和Q ExactiveTM HF-X 質譜儀進行二級質譜檢測，生成質譜檢測原始數據(.raw)。

1.6 質譜數據分析 根據UniPort蛋白數據庫使用搜庫軟件Proteome Discoverer 2.2(PD2.2，Thermo)搜索全部的結果譜圖[13]。為了提高分析結果質量，PD2.2 軟件對檢索結果進一步過濾：可信度在99%以上的譜肽(Peptide Spectrum Matches，PSMs)為可信PSMs，至少包含一個unique 肽段(特有肽段)的蛋白為可信蛋白，只保留可信的譜肽和蛋白，并做FDR 驗證，去除FDR大于1% 的肽段和蛋白。

1.7 生物信息學分析 利用GO[13]和KEGG[14]數據庫對鑒定到的蛋白質進行功能注釋，以了解不同蛋白質的功能特性。使用Cell-mPLOC 2.0網站[15]預測蛋白質的亞細胞定位信息。使用SignalP網站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)[16]預測所鑒定蛋白的信號肽序列及其切割位點。

2 結 果

2.1 質譜鑒定的TM分泌蛋白 本實驗取兩個獨立重復樣本進行分泌蛋白鑒定，共鑒定出分泌蛋白43個，其中樣本一為31個，樣本二為33個。對兩個樣本的結果取交集，得到21個分泌蛋白(圖1)，具體的分泌蛋白組分見表1。

表1 鑒定的TM分泌蛋白詳細信息

圖1 兩個樣本的TM分泌蛋白數量

2.2 鑒定的TM分泌蛋白的分子量和pI分布 本研究中鑒定的TM分泌蛋白分子量最低的為17.0 kDa(A0A5Q0PGZ4，核苷二磷酸激酶)，分子量最高的為169.1 kDa(A0A5Q0PT05，Septin型G結構域蛋白)，平均分子量為50.0 kDa(圖2A)。本項研究的鑒定蛋白的pI值在5.03(A0A5Q0PBN9，該蛋白還未鑒定)到9.32(A0A5Q0PHS7，肽基脯氨酰順反異構酶)之間，平均值為6.69(圖2B)。

圖2 鑒定出的TM分泌蛋白的分子量(A)和pI(B)分布

2.3 TM分泌蛋白功能注釋 GO分析顯示，TM分泌蛋白主要參與超氧化物代謝、壓力應對、金屬離子轉運、氧化還原過程和DNA復制等生物學過程；主要的分子功能涵蓋核酸結合、金屬離子結合、水解酶活性等；蛋白質的細胞組分主要為細胞核、質膜和MCM復合體等(圖3A)。而亞細胞定位分析顯示，TM分泌蛋白主要定位于細胞核、細胞外、質膜、線粒體和細胞膜等(圖3B)。

圖3 TM分泌蛋白GO功能富集(A)和亞細胞定位(B)注釋圖

2.4 TM分泌蛋白通路富集 KEGG通路富集分析顯示，TM分泌蛋白主要參與遺傳信息、代謝以及生物系統通路。遺傳信息通路為核酸折疊、分類和降解；代謝通路包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔助因子代謝、維生素代謝和核苷酸代謝；生物系統通路包括環境適應和免疫系統通路。見圖4。

圖4 TM分泌蛋白KEGG通路富集注釋圖

2.5 TM分泌蛋白信號肽及剪切位點分析 用SignalP網站預測所鑒定蛋白的信號肽序列及其切割位點，結果顯示，僅有6個蛋白(A0A5Q0PEB7、A0A5Q0PMA9、A0A5Q0PPZ5、A0A5Q0PS50、A0A5Q0PYY6和A6NAD8)存在信號肽序列，其N端序列以及剪切位點信息如表2所示。

表2 TM分泌蛋白的信號肽及剪切位點信息

3 討 論

病原體分泌蛋白在其感染致病過程中發揮著重要作用，研究表明結核分枝桿菌、沙門氏菌等可以通過分泌蛋白抑制宿主免疫殺傷作用，促進自身在巨噬細胞的存活和增值[17-19]。然而，國內外對馬爾尼菲籃狀菌的分泌蛋白組研究甚少，目前僅對毒力因子Mp1p的研究較為深入。因此，本研究通過質譜技術，構建了TM的分泌蛋白譜，共定性了21個分泌蛋白。生物信息學分析顯示，TM分泌蛋白在真菌代謝、環境適應和免疫反應等方面發揮重要作用。

根據GO富集結果顯示，TM分泌蛋白主要參與超氧化物代謝(超氧化物歧化酶)、壓力應對(Septin型G結構域蛋白)和金屬離子轉運(鎂轉運蛋白)等生物學過程，這可能與TM感染介導的免疫逃逸和侵染宿主細胞有關。超氧化物歧化酶已經被證明是多種病原體的毒力因子，作為一種抗氧化酶，超氧化物歧化酶具有較強的抗炎反應，能夠下調巨噬細胞產生的炎癥因子、ROS等[20-21]。Septin蛋白作為一種細胞支架蛋白，可調控病原體的出芽、分裂等生理過程，同時在多種細菌侵入、感染宿主過程中扮演重要角色[22]。研究表明，金屬轉運蛋白也是真菌重要的毒力因子，涉及真菌致病性的多個方面[23]。本研究中鑒定的鎂轉運蛋白，已被證明是新型隱球菌毒力的重要調控因子[24]，但是該蛋白在TM中發揮何種作用，還需進一步研究。

Mp1p蛋白是目前研究較為明確的TM毒力因子，與超氧化物歧化酶類似，Mp1p也是一種抗炎物質，目前已知的機制是通過與花生四烯酸(AA)結合，從而抑制巨噬細胞的炎癥反應[4-5]。本次研究中我們在TM分泌蛋白也鑒定出Mp1p，佐證了實驗的準確性。然而，在本研究鑒定的21種蛋白中，有5種蛋白在數據庫中未能找到相應注釋(Uncharacterized protein)，這表明TM分泌蛋白具有較大的研究潛力。其他16種蛋白除了Mp1p外，其余均未得到深入的研究。

信號肽是蛋白質N-末端一段疏水性氨基酸序列，用于引導蛋白質轉移的短肽鏈。蛋白質到達轉運位置后，信號肽會被信號肽酶進行切除，其中真菌的信號肽酶為一型信號肽酶(SPaseI)，SignalP便是基于以上原理對分泌蛋白進行預測。本研究預測結果顯示，僅有6種蛋白質存在信號肽，這提示分泌蛋白并不是都通過信號肽的方式進行轉運。研究表明，真菌分泌蛋白可通過多種途徑轉移至胞外，包括與分泌小泡結合或進入內體亞小室、被動運輸、膜翻轉和膜易位等[25]。有趣的是，預測結果顯示有部分分泌蛋白定位到細胞核、質膜、線粒體和細胞膜等位置，其分泌至胞外發揮何種生物學作用尚未明確，因此，未來還需要對TM分泌蛋白進行更深入的功能研究。值得注意的是，本研究使用質譜技術所鑒定的蛋白可能存在一定的假陽性，且分泌蛋白的功能分析也僅基于生物信息學推測所得，因此，未來還需使用體外實驗結合生物學手段進行驗證。

利益沖突：無

引用本文格式：韋吳迪，王剛，何錦豪，等.馬爾尼菲籃狀菌分泌蛋白的鑒定及功能預測分析[J].中國人獸共患病學報，2022，38(1)：19-24.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.170