河北省野鼠立克次體感染調查

刁丹紅, 王蔣麗, 郭文平, 李彩云, 楊歡歡, 李雁飛, 謝廣成

立克次體(Rickettsia)為原核單細胞微生物，其專性寄生于真核細胞內。由該類菌引起的立克次體病是一類重要的人獸共患疾病[1-2]。近年來，世界范圍出現多種新發及再發立克次體病[3-5]。我國在新疆、黑龍江、云南等地野生動物和/或患者樣本中檢出或分離到某些致病性立克次體[6]。

由于立克次體嚴格胞內寄生這一特性，人們很難用傳統的細菌學分類手段對該類菌進行區分。16SrRNA基因由于其高變區有種屬特異性，保守區在各細菌之間差異不大的特點，已經成為最適合細菌屬種分類鑒定的目的基因[7-8]。立克次體屬的檸檬酸合成酶基因(gltA)、外膜蛋白A(ompA)基因為鑒定立克次體種的常用基因[9]。立克次體的ompA基因序列具有種內差異，為種內菌株分型的目的基因[10]。

本研究捕獲河北省南部和東北部兩個特定地區的野鼠作為調查對象，擴增鼠脾臟樣本的立克次體16SrRNA、ompA、gltA基因，并對擴得的目的基因片段測序，對測定的基因序列進行同源性比對和系統發生樹分析，研究當地立克次體的遺傳特征和流行特征，為當地立克次體病預防與控制提供重要數據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備與試劑 PCR儀(Applied Biosystem，美國)、凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)、電泳儀(北京六一儀器廠，北京)、組織研磨機(上海凈信實業有限公司，上海)、核酸提取儀(江蘇碩世生物科技股份有限公司，江蘇)、PCR master Mix(TIANGEN，北京)。

1.2 野鼠樣本采集 2020年4月-9月，在河北省邯鄲市及承德市選取的5個鄉鎮用粘鼠板和鼠籠法捕獲野鼠，其中邯鄲市50只，承德市50只，分別編號登記，無菌操作解剖，取脾臟樣本，-80 ℃ 凍存待檢。

1.3 脾DNA提取 每只鼠分別取約10 mg脾臟組織用研磨機進行研磨，使用碩世生物科技有限公司的組織DNA提取試劑盒(磁珠法)提取脾臟組織全DNA，并保存于-20 ℃ 備用。

1.4 PCR擴增 根據文獻[11]中的引物(表1)采用半巢氏PCR進行立克次體16SrRNA、ompA、gltA基因的擴增，其中16SrRNA分為兩段進行擴增。擴增條件為：94 ℃ 5 min后；94 ℃ 40 s、50 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s，循環35次；最后72 ℃ 7 min。二輪擴增的PCR程序與第一輪相同。16SrRNA前后兩半段、ompA、gltA擴增產物目的片段的大小分別為950 bp、700 bp、750 bp和1 000 bp。

表1 本研究所用引物

1.5 序列分析及遺傳進化特征分析 PCR陽性產物送至北京擎科生物技術有限責任公司進行測序，所得序列先用blast進行比對分析，然后用Lasergene程序計算序列之間的同源性，用MEGA 6.0中的最大似然法(ML)構建系統發生樹，核苷酸替代模型為GTR+I+G，分析采用Bootstrap Replication的值為100。

2 結 果

2.1 PCR電泳結果 在河北省邯鄲市和承德市分別采集50只野鼠，根據形態學特征與線粒體cytb基因分析，邯鄲市捕捉到的老鼠為黑線姬鼠，承德市捕捉到的為褐家鼠。將100只鼠的脾臟組織分別提取DNA做模板，采用PCR擴增立克次體的16SrRNA基因，然后擴增陽性標本的ompA基因及gltA基因，擴增產物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳成像。結果檢出6只野鼠樣本的3個目的基因擴增均為陽性(圖1)，4個目的基因擴增片段分別約為950 bp、700 bp、750 bp和1 000 bp，與預期目的片段大小相符。承德市褐家鼠的立克次體感染率為8%(4/50)，邯鄲市黑線姬鼠的立克次體感染率為4%(2/50)。

M:DL2000 maker; 1-6:鼠脾臟樣本

2.2 16SrRNA基因測序結果分析 將6株立克次體的16SrRNA基因進行同源性分析，它們之間的同源性為99.9%～100%。此外，這6條16SrRNA基因序列與GenBank中勞氏立克次體相應基因之間的序列同源性最高，為99.9%～100%。下載GenBank中立克次體的已知16SrRNA基因序列，用MEGA 6.0中的ML方法構建的系統發生樹(圖2)。在16SrRNA基因序列的系統發生樹上，本研究中檢出的6個菌株與勞氏立克次體有最密切的親緣關系，位于同一分支。提示從河北兩地野鼠中檢出立克次體均為斑點熱群的勞氏立克次體。本研究中獲得的16SrRNA基因序列的GenBank登記號為MZ292055～MZ292060。

圖2 基于立克次體16S rRNA基因序列構建系統進化樹

2.3ompA基因和gltA基因測序結果分析 本研究中獲得的6條立克次體的ompA基因的同源性為99.7%～100%；此外，這6條ompA基因序列與GenBank中勞氏立克次體相應基因序列之間的同源性最高，為98.8%～100%。采用ompA基因序列構建的系統發生樹上，結果顯示河北6個立克次體菌株與勞氏立克次體有最密切的親緣關系，與我國其它地區檢出的勞氏立克次體位于同一分支。本研究中獲得的6條立克次體的gltA基因的同源性為100%；此外，這6條gltA基因序列與GenBank中勞氏立克次體相應基因序列之間的同源性最高，為99.9%～100%。采用gltA基因序列構建的系統發生樹上，結果顯示河北立克次體與勞氏立克次體的位于同一分支，與我國其它地區發現的勞氏立克次體的親緣關系最近(圖3)。本研究中獲得的ompA與gltA基因序列的GenBank登記號為MZ297803～MZ297814。

圖3 基于立克次體ompA基因(左)與gltA基因(右)序列構建系統進化樹

3 討 論

本課題從河北省南部和東北部兩個代表性地區捕捉野鼠提取鼠脾臟的DNA樣本，采用PCR方法擴增鼠樣本的立克次體16SrRNA、ompA和gltA基因進行立克次體的檢測與鑒定。脾臟是重要的機體免疫器官，是血液循環過程的一個過濾器官，因此血液中的病原體會經過脾臟，它們可能被脾臟免疫活性細胞吞噬清除，某些病原體可以在脾臟細胞內生長繁殖，再次進入血液。因此，脾臟組織是否帶菌可以作為機體是否曾發生過或正存在菌血癥的一種反映。同時，有研究結果顯示，脾臟組織檢查適合監測依靠鼠作為貯存宿主而傳播的病原體[12]。因此，通過動物宿主研究病原體存在狀況時，我們應根據所研究病原體的組織親嗜性特征選擇對應靶器官或組織。因此，本研究選取了脾臟組織標本進行立克次體的檢測。檢測結果表明邯鄲與承德市的嚙齒動物立克次體感染陽性率為6%，同源性與系統發生樹分析證明野鼠攜帶的立克次體病原體為勞氏立克次體。本研究中，鼠的立克次體感染率與內蒙古西部口岸地區嚙齒動物攜帶立克次體的陽性率一致(6.18%)[13]，高于云南省瀘西縣和黑龍江省遜克縣嚙齒動物中立克次體的陽性率[14-15]，但遠遠低于新疆北疆地區嚙齒動物中立克次體的陽性率(34%)[16]。

能夠感染人的立克次氏體目成員包括無形體科與立克次體科。其中的立克次體科又包含立克次體屬和東方體屬。而立克次體屬又可分為斑疹傷寒群立克次體和斑點熱群立克次體。目前國際上已經鑒定出30余種斑點熱群立克次體，其中已經證明對人致病的有20多種[9]。在我國，已發現的立克次體也有10多種[17]。在2015-2016年，內蒙古、河南、山東等地已報道勞氏立克次體感染的病例[18]。在此次研究中，河北檢出的6株立克次體與黑龍江、內蒙古分離出的勞氏立克次體有最密切的親緣關系。河北省位于中國華北地區，東南部、南部銜山東和河南省，北部與內蒙古交界。我們的研究證明河北省部分區域的野鼠攜帶立克次體，野生嚙齒動物為立克次體貯存宿主，因此這些野鼠生活地區可為立克次體感染的自然疫源地。下一步我們將擴大河北省區域篩查范圍，除檢查野生嚙齒動物外，也檢測蜱作為傳播媒介攜帶立克次體種類和感染水平，以判斷哪些立克次體病原體有傳播的可能性，為河北省立克次體病的預防和控制提供可靠數據支持。

利益沖突：無

引用本文格式：刁丹紅,王蔣麗,郭文平，等.河北省野鼠立克次體感染調查[J].中國人獸共患病學報，2022，38(1)：84-88.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.168