遵義市核苷類似物干預下慢性乙型病毒性肝炎患者乙型肝炎病毒多聚酶區基因突變檢測分析

楊開余

563000 貴州航天醫院，貴州遵義

慢性乙型病毒性肝炎簡稱乙肝，是由于乙型肝炎病毒(HBV)感染而致，臨床主要表現為全身乏力、惡心、嘔吐、厭食等癥狀。一旦確診需積極進行治療，如抗病毒、抗纖維化、保肝治療等[1]。目前，臨床多采用核苷類似物治療慢性乙型病毒性肝炎患者，然而由于核苷類似物種類較多，應用廣泛，導致慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 耐藥性越來越強，嚴重影響患者的臨床療效。基于此，本研究通過了解遵義市核苷類似物干預下慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 多聚酶區基因突變類型及發生率，以及不同核苷類似物耐藥率、突變位點等情況，旨在為患者的臨床治療提供更多的參考，提高患者療效，現報告如下。

資料與方法

選取2018年12月-2019年12月在貴州航天醫院就診的102 例慢性乙型病毒性肝炎患者為研究對象，包括男56例，女46例；年齡25～76歲，平均(45.87±5.42)歲。

納入標準：①符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》中的診斷標準；②核苷酸類似物治療＞6 個月；③血清HBV DNA 出現病毒學突破(HBV DNA較最低值升高＞2 log10copies/mL)；③知悉本次研究并自愿參與，簽署知情同意書。

排除標準：①非慢性乙型病毒性肝炎者；②合并其他腫瘤疾病、免疫性疾病者；③臨床資料缺失者；④不同意參與該研究者。

方法：①血清HBV DNA 提取：采用北京生物科技有限公司生產的核酸提取試劑提取患者血清HBV DNA 100 μL，在血清中加入100 μL 核酸提取液A，混勻10 s，離心10 min，離心轉速12 000 r/min，之后將血清上清液抽干后加入25 μL 核酸提取液B，混勻10 s，置入100℃環境下保溫10 min，最后離心10 min，離心轉速12 000 r/min，并將上清液作為模板。②HBV 多聚酶區(P)基因突變檢測：采用序列特異性PCR 技術檢測患者HBV 多聚酶區(P)基因突變情況。根據HBV P 區基因的保守序列，采用Primer Premier 5.0 軟件包設計引物序列，引物由武漢金開瑞生物技術公司合成，序列：a.外側正向引物ESP：5'-AGG CCT TAT AAG TTG GCG A-3'，反向引物EAP：5'-TCC TGC TCA AGG AAC CTC TA-3'；b.內側正向引物ISP：5'-CY(T/C)T GTA TTC CCA TCC CAT C-3'；c.反向引物IAP：5'-TGA CAT ACT TTC CAA TCA ATA GG-3'。目的片段共370 bp，涵蓋了目前已知的主要HBV 核苷類抗病毒藥物耐藥突變位點。結果判斷：血清HBV DNA＜500 copies/mL 為陰性。PCR 反應體系配置：第1 輪PCR 序列擴增：10×擴增緩沖液2.5 μL，模板DNA 2 μg，Taq DNA 聚合酶1 U，MgCl21.5 μmol/L，dNTP 2 μL，ESP、EAP 各1 μmol/L等；第2 輪PCR 序列擴增：10×擴增緩沖液5 μL，模板DNA 2 μg，Taq DNA 聚合酶2 U，MgCl23 μmol/L，dNTP 2 μL，ESP、EAP 各1 μmol/L、第1 輪產物1 μL等[2-3]。血清HBV基因型、P區基因的序列及編碼氨基酸的分析：以NCBI基因分型中23株基因型為A-H型的HBV 全基因組標準序列為參照來確定基因型；采用BIOEDIT 軟件包(版本7.0.9)進行核酸和氨基酸序列的比對，分析氨基酸的變異，用于比對的參考序列包 括A 型(M57663 和X02763)、B 型(D00331 和D00329)、C 型(AY12304l 和X75656)及D 型(X02496 和X97848)。

觀察指標：觀察102 例慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 多聚酶區基因突變類型及發生率。觀察102例慢性乙型病毒性肝炎患者核苷類似物耐藥率及其突變位點，主要核苷類似物包括拉米夫定、阿得福韋酯、恩替卡韋、替比夫定等。

結 果

102例慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 多聚酶區基因突變類型及發生率：經檢測，102 例慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 多聚酶區基因突變類型主要有單純變異、聯合變異、混合變異。共發生19 種基因突變類型，其中以單純rtM204 I 突變最多(38.24%)，其次為rtM204V/rtL180M聯合變異(27.45%)。見表1。

表1 102例慢性乙型病毒性肝炎患者HBV多聚酶區基因突變類型及發生率

102 例慢性乙型病毒性肝炎患者核苷類似物耐藥率及其突變位點：102 例慢性乙型病毒性肝炎患者中，拉米夫定耐藥率為59.80%(61/102)，突變位點主要為rtM204V、rtM204I、rtL180M 等；阿得福韋酯耐藥率為42.16%(43/102)，突變類型為單獨rtA181S、rtA181T 及聯合rtN236T 等；恩替卡韋耐藥率為22.55%(23/102)，突變類型為 rtA181V/rtQ215H、rtM204V/rtL180M+rtA181T+rtN236T 等；替比夫定耐藥率為18.63%(19/102)，突變類型為單獨rtM204I。見表2。

表2 102例慢性乙型病毒性肝炎患者核苷類似物耐藥率及其突變類型

討 論

臨床多采用核苷類似物治療慢性乙型病毒性肝炎，常見藥物如拉米夫定、阿得福韋酯、恩替卡韋、替比夫定等，此類藥物具有服用簡便、不良反應低、病毒復制抑制能力強等特點，因而在治療慢性乙型病毒性肝炎中應用廣泛，且這些藥物在慢性乙型病毒性肝炎中的療效得到了肯定[4]。然而，隨著核苷類似物長期使用，其可誘導患者的HBV 基因發生突變，耐藥性也隨之增強，影響了患者臨床療效。

目前，所有口服核苷類似物(包括拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋和替比夫定)在慢性乙型病毒性肝炎治療過程中均可出現耐藥性。細胞試驗發現，拉米夫定耐藥的病毒株對恩替卡韋顯型敏感性降低8～30 倍。如果乙肝病毒多聚酶本來就存在對拉米夫定耐藥的氨基酸置換(rtL180M 和/或rtLM204V/I)，再加上rtT184、rtS202 或rtM250 位點的置換變異，都會造成對恩替卡韋的顯型敏感性降低更多(＞70 倍)。然而，對耐藥相關的一些問題國內外均沒有共識。有專家認為，肝臟基礎好的慢性乙型病毒性肝炎患者如果抗病毒耐藥后，最好在出現臨床耐藥的時候換藥，因為此時患者出現病毒反跳，酶學增高，此時換藥有利于免疫清除病毒；而對于肝硬化，尤其是失代償期肝硬化或肝移植患者最好在基因型耐藥時換藥，以免肝功能失代償。因此，對于慢性乙型病毒性肝炎患者，在出現耐藥后應及時換藥或聯合治療，避免加重患者病情。

本研究通過檢測發現，慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 多聚酶區基因突變類型達19 種之多，其中以單純rtM204I 突變最多(38.24%)，其次為rtM204V/rtL180M 聯合變異(27.45%)；且在核苷類似物耐藥率及其突變位點檢測中發現，拉米夫定(59.80%)具有極高的耐藥性，突變位點也較多，其次為阿得福韋酯(42.16%)、恩替卡韋(22.55%)和替比夫定(18.63%)。有研究表明，拉米夫定在治療慢性乙型病毒性肝炎中，藥物使用時間越長，HBV 多聚酶區基因突變發生率越高[5]。因此，根據本次研究，在治療慢性乙型病毒性肝炎患者時，通過檢測患者HBV 多聚酶區基因突變情況，選擇合適的藥物進行治療，更有利于提高患者的臨床療效。