丹參素異丙酯對D-半乳糖致衰老大鼠腎臟的保護作用

施 念，王志紅，王世祥，鄭曉暉，謝瀅瀅，程亮星，趙松峰

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院物理診斷科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450014 3)西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西安 710069 4)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院《腫瘤基礎(chǔ)與臨床》編輯部 鄭州 450052 5)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450052

衰老是指生物體隨年齡增加，機體多種器官發(fā)生退行性變、功能減退，進而死亡的一種不可逆的自然現(xiàn)象。衰老的自由基學(xué)說和線粒體學(xué)說認(rèn)為，氧自由基造成的損傷是細(xì)胞衰老的主要原因之一[1]。丹參素異丙酯[isopropyl-3-(3,4-dihydro-xyphenyl)-2-hydroxypropanoate，IDHP]是采用代謝組學(xué)分析復(fù)方丹參方藥物成分時發(fā)現(xiàn)的一種代謝物。既往研究[2-3]證實，IDHP具有舒張血管、延緩腦衰老、對抗心肌缺血再灌注損傷等作用，但是否對衰老大鼠腎臟組織具有抗氧化作用尚不清楚。本實驗觀察了D-半乳糖(D-galactose，D-gal)致衰老大鼠腎臟組織的形態(tài)學(xué)和功能性變化，并通過觀察IDHP干預(yù)對衰老大鼠腎臟組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)、過氧化脂質(zhì)(lipid peroxides，LPO)水平的影響，探討IDHP的抗氧化作用機制，以期為IDHP在抗衰老中的后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑6個月齡健康Wistar大鼠40只[動物合格證號：SCXK(豫)2005-0001]由河南省實驗動物中心提供，雄雌各半，雄性體重310～340 g，雌性體重230～250 g。IDHP(批號：2006-2)由西安交通大學(xué)-西北大學(xué)中草藥現(xiàn)代化研究及工程中心饋贈；D-gal購自美國Amresco公司；維生素E(vitamin E，VE)注射劑購自上海通用藥業(yè)股份有限公司；考馬斯亮藍(lán)試劑盒及SOD、GSH-Px、CAT、MDA、LPO檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物分組及給藥方法40只Wistar大鼠按性別采用隨機數(shù)字表法均分為空白對照組、衰老模型組、VE(100.0 mg/kg)組、高劑量IDHP(21.0 mg/kg)組和低劑量IDHP(7.0 mg/kg)組5組，每組8只。空白對照組：皮下注射8.5 g/L氯化鈉溶液4 mL/(kg·d)；衰老模型組：分別皮下注射25 g/L D-gal溶液2 mL/(kg·d)、8.5 g/L氯化鈉溶液2 mL/(kg·d)；VE組、高劑量IDHP組和低劑量IDHP組：分別皮下注射25 g/L D-gal溶液2 mL/(kg·d)、相應(yīng)濃度的藥物2 mL/(kg·d)，即50.0 g/L VE溶液、10.5 g/L IDHP溶液、3.5 g/L IDHP溶液。連續(xù)注射8周。

1.3 標(biāo)本采集各組大鼠在末次給藥1 h后，稱體重，腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉4.0 mL/kg進行麻醉，經(jīng)下腔靜脈采血，然后取出雙側(cè)腎臟并稱取總質(zhì)量。

1.4 腎臟指數(shù)計算參考文獻(xiàn)[4]，根據(jù)大鼠體重和雙側(cè)腎臟總質(zhì)量，計算腎臟指數(shù)：腎臟指數(shù)=腎臟質(zhì)量(g)/大鼠體重(kg)。

1.5 血清肌酐、尿素水平檢測采集的靜脈血常溫條件下4 000 r/min離心10 min后，取上清液，采用7020型全自動生化分析儀(日本Hitachi公司)檢測血清肌酐、尿素水平。

1.6 腎臟組織細(xì)胞形態(tài)觀察左側(cè)腎臟經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定24 h，常規(guī)方法制成石蠟塊，切片，厚度4 μm，進行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 腎臟組織氧化損傷指標(biāo)檢測右側(cè)腎臟用4 ℃預(yù)冷8.5 g/L氯化鈉溶液沖洗，濾紙吸干，用8.5 g/L氯化鈉溶液制成組織勻漿，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，取上清液，測SOD、GSH-Px、CAT、MDA、LPO。SOD用黃嘌呤氧化酶法，GSH-Px用5,5-雙硫代對硝基苯甲酸顯色法，CAT用鉬酸銨法，MDA和LPO用硫代戊巴比妥法，總蛋白定量用考馬斯亮藍(lán)法。所有操作均按照試劑盒說明書進行。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。各組腎臟指數(shù)，血清肌酐、尿素水平，腎臟組織SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA、LPO水平的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎臟指數(shù)比較與空白對照組相比，衰老模型組大鼠腎臟指數(shù)降低；與衰老模型組相比，VE組、高劑量IDHP組和低劑量IDHP組大鼠腎臟指數(shù)升高；與低劑量IDHP組相比，VE組、高劑量IDHP組大鼠腎臟指數(shù)升高。見表1。

2.2 各組大鼠血清肌酐、尿素水平比較與空白對照組相比，衰老模型組大鼠血清肌酐、尿素水平升高；與衰老模型組相比，VE組、高劑量IDHP組和低劑量IDHP組大鼠血清肌酐、尿素水平降低；與低劑量IDHP組相比，VE組、高劑量IDHP組大鼠血清肌酐、尿素水平降低。見表1。

表1 各組大鼠腎臟指數(shù)和血清肌酐、尿素水平比較(n=8)

2.3 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞形態(tài)變化空白對照組大鼠腎臟組織無明顯病理改變，腎小球密集分布，結(jié)構(gòu)完整清晰，多呈圓形或橢圓形，腎小球囊囊腔、腎小管管腔規(guī)則且無明顯擴張，間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤和纖維化。衰老模型組腎小球數(shù)量明顯減少，分布稀疏，球體縮小且形狀不規(guī)則，腎小球囊囊腔、腎小管管腔明顯擴張并可見少量腎小管壞死，間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤和少量纖維化。VE組、高劑量IDHP組鏡下表現(xiàn)接近空白對照組，僅可見少量腎小管管腔擴張。低劑量IDHP組相對于衰老模型組有明顯改善，腎小球數(shù)量增多，形態(tài)趨于正常，但腎小球囊囊腔、腎小管管腔擴張仍然存在，改善程度不及VE組、高劑量IDHP組。見圖1。

A：空白對照組；B：衰老模型組；C：VE組；D：高劑量IDHP組；E：低劑量IDHP組

2.4 各組大鼠腎臟組織氧化損傷指標(biāo)比較與空白對照組相比，衰老模型組大鼠腎臟組織SOD、GSH-Px、CAT活性降低，而MDA、LPO水平升高；與衰老模型組相比，VE組、高劑量IDHP組和低劑量IDHP組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性升高，而MDA、LPO水平降低；與低劑量IDHP組相比，VE組、高劑量IDHP組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性升高，而MDA、LPO水平降低。見表2。

表2 各組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA、LPO水平比較(n=8)

3 討論

自由基學(xué)說、線粒體學(xué)說等[4-6]認(rèn)為，自由基主要產(chǎn)生于線粒體的呼吸鏈，并可由機體中的酶類或抗氧化劑清除。自由基參與多種氧化反應(yīng)，造成生物大分子結(jié)構(gòu)改變、功能喪失，從而加快了衰老的進程。腎臟是機體衰老過程中組織損傷的典型靶器官，對氧化損傷高度敏感，結(jié)構(gòu)改變和功能衰退進展很快[7]。D-gal可在醛糖還原酶催化下還原成不被機體代謝的半乳糖醇，因而一定時間內(nèi)連續(xù)注射D-gal會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)半乳糖醇過量，通過影響細(xì)胞內(nèi)正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞自身腫脹及細(xì)胞器功能異常、代謝功能異常等，最終導(dǎo)致機體出現(xiàn)退行性變化。因此，利用D-gal可以制作大鼠衰老模型，且其組織器官的器質(zhì)性變化和功能改變以及可客觀測量指標(biāo)變化等均與自然衰老大鼠相近[8]。

腎臟指數(shù)是反映腎臟衰老程度的重要指標(biāo)，而腎臟組織細(xì)胞形態(tài)變化和血清肌酐、尿素水平可以評估腎臟衰老相關(guān)的功能性和器質(zhì)性損傷[4，9]。SOD、GSH-Px、CAT均為抗氧化酶類，正常情況下主要發(fā)揮保護細(xì)胞膜和線粒體膜等生物膜完整性的作用。SOD是體內(nèi)唯一以超氧陰離子為底物的酶，對氧自由基的清除起著至關(guān)重要的作用；GSH-Px是一種重要的過氧化物分解酶；CAT則是催化過氧化氫分解成氧和水的酶。上述3種酶類均可以通過發(fā)揮抗氧化作用減輕機體過氧化造成的損傷，其水平在一定程度上反映了機體抗氧化能力，由于機體衰老過程中伴隨抗氧化能力不斷下降，其還可以間接反映機體衰老程度[10-11]。MDA是氧自由基作用下生物膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物。機體MDA水平可以直接用于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度評估，也可以間接反映體內(nèi)氧由基水平[12]。LPO是一種自由基或活性氧作用于不飽和脂肪酸鏈后產(chǎn)生的含有過氧基的脂質(zhì)，已被證實可以準(zhǔn)確反映機體的脂質(zhì)過氧化程度[13]。衰老過程中已經(jīng)被證實存在較嚴(yán)重的脂質(zhì)過氧化情況，因此MDA、LPO均可以反映機體的脂質(zhì)過氧化程度，間接反映機體衰老程度。

復(fù)方丹參方具有抗心肌缺血、抗動脈粥樣硬化的作用，具體作用機制尚未完全闡明。IDHP作為復(fù)方丹參方中的主藥丹參的人體代謝物，在前期基礎(chǔ)研究[2-3]中已經(jīng)被證實具有舒張血管、延緩腦衰老、對抗心肌缺血再灌注損傷等作用，且可能與其抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)、促進血管生成等有關(guān)。本研究通過比較衰老模型組和空白對照組大鼠氧化損傷指標(biāo)和腎臟指數(shù)等發(fā)現(xiàn)D-gal能夠?qū)е聶C體過氧化損傷，能夠成功制作衰老模型，還經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)其他各治療組對這些指標(biāo)顯示出明顯的改善效應(yīng)，且IDHP的抗氧化作用可能具有一定的劑量依賴性，并且一定量的IDHP可以達(dá)到和VE相近的作用，這進一步證實了IDHP延緩機體衰老的作用，并探析了其可能的機制。

綜上所述，IDHP用于D-gal致衰老大鼠，可以延緩其腎臟衰老，其機制可能與IDHP的抗氧化作用有關(guān)。

致謝:感謝鄭州大學(xué)付潤芳、苑帥、周斐、曾宏玲、陳淼、仵菲斐在實驗操作中的幫助。