CRAMP對小鼠心臟成纖維細胞激活、增殖和膠原分泌功能的影響

董 偉，羅 強，高 路，肖莉麗

1)鄭州大學第一附屬醫院兒科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院心血管內科 鄭州 450052

當心臟損傷時，心臟中靜止的成纖維細胞開始激活分化成為具備增殖能力的肌成纖維細胞，肌成纖維細胞大量表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)，分泌大量的膠原[1]。這種應激反應在早期對損傷的心臟具有代償作用，然而持續不斷的肌成纖維細胞激活和膠原分泌，導致心臟細胞外基質過度沉積，心臟僵硬度增加，心肌傳導受損，最終影響心臟的舒縮功能[2-3]。因此阻斷心臟急性損傷所致的心肌纖維化對預防心力衰竭至關重要。抗菌肽在小鼠中為導管素相關抗菌肽(cathelicidin-related antimicrobial peptide,CRAMP)，在人類中為白細胞介素-37，多表達于免疫細胞、上皮細胞和生殖細胞[4-5]。CRAMP是一種免疫調節劑，在人類多種疾病中發揮重要作用，如動脈粥樣硬化、1型糖尿病[6]。最近研究[4-5，7-8]發現CRAMP可以抑制心臟缺血/再灌注損傷，改善心肌梗死心臟功能障礙，還可以通過激活AKT通路抑制心肌肥厚。但是CRAMP是否能夠抑制成纖維細胞的激活、增殖和膠原分泌功能，尚不清楚。因此，我們采用小鼠心臟成纖維細胞，探討CRAMP對成纖維細胞激活、增殖和膠原分泌功能的影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑小鼠重組CRAMP蛋白購于Innovagen AB公司，轉化生長因子β1(TGF-β1)購于Sigma公司。本實驗所用一抗包括總的(total，T-)Smad2、Smad3以及磷酸化的(phosphorylated，p-)Smad2、Smad3，購于Cell Signaling Technology公司，Smad4、GAPDH購于Santa Cruz公司，α-SMA抗體和Ⅲ型膠原抗體購于Abcam公司；二抗為羊抗鼠IgG，購于LI-COR公司；反轉錄試劑盒購于Roche公司；細胞培養所用DMEM-F12培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購于Gibco公司。

1.2 小鼠心肌成纖維細胞的分離和培養取6～8周齡的C57BL6J小鼠(購于北京華阜康生物公司)，頸椎脫臼處死后，在體積分數75%乙醇中消毒后剪開胸腔，快速取出心臟，去除心房和右心室后置于預冷的D-Hank′s液中沖洗，在含1.25 g/L胰蛋白酶和1 g/L膠原酶的DMEM-F12培養基中剪碎后消化5次，每次10 min，收集消化液離心去上清，將細胞在含有體積分數15%胎牛血清的DMEM-F12中重懸，用40 μm過濾網過濾后接種于直徑10 cm大皿中，90 min后貼壁細胞即為心肌成纖維細胞，采用α-SMA染色進行鑒定[9]。

1.3 細胞處理第一部分實驗細胞分為3組，每組6復孔，實驗重復3次。對照組：細胞不給予任何處理；TGF-β1組：細胞給予10 mg/L TGF-β1處理48 h；CRAMP組：細胞給予10 mg/L TGF-β1處理48 h后再給予0.5 mg/L CRAMP處理24 h[8]。

第二部分實驗細胞分為3組，每組6復孔，實驗重復3次。TGF-β1組：細胞給予10 mg/L TGF-β1處理48 h；SIS3組：細胞給予10 mg/L TGF-β1處理48 h后再給予Smad 3抑制劑SIS3 10 μmol/L處理24 h；CRAMP+SIS3組：細胞給予10 mg/L TGF-β1處理48 h后再給予CRAMP 0.5 mg/L和SIS3 10 μmol/L處理24 h。

1.4 細胞增殖活性的MTT檢測在96孔板加入10 μL 5 g/L MTT溶液，在培養箱中孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO，酶標儀檢測570 nm處吸光度值。設置只加細胞不做任何處理的孔板作為對照孔。細胞增殖活性=樣本吸光度值/對照孔吸光度值。

1.5 α-SMA、Ⅲ型膠原和PCNA蛋白的免疫熒光染色細胞處理后加入40 g/L多聚甲醛固定5 min，采用體積分數0.02% Triton100 通透5 min，PBS洗滌后用體積分數8%羊血清封閉1 h，采用抗α-SMA和抗Ⅲ型膠原抗體(1∶100稀釋)共同孵育細胞過夜，采用紅色和綠色熒光二抗孵育細胞，采用DAPI進行核染色，熒光顯微鏡下觀察并拍照；對于PCNA染色，采用抗PCNA(1∶1 000稀釋)孵育細胞過夜，采用紅色熒光二抗孵育細胞，采用DAPI進行核染色，熒光顯微鏡下觀察并拍照。采用Image J軟件分析α-SMA和Ⅲ型膠原的熒光亮度；PCNA陽性細胞即細胞染色為紅色，核染色為藍色，PCNA陰性細胞只有核染色為藍色，每組選擇6個200倍視野，計數PCNA陽性細胞數。

1.6 Ⅲ型膠原、α-SMA mRNA表達的RT-PCR檢測采用Trizol進行細胞總RNA的提取，測定RNA濃度和純度，采用反轉錄試劑盒將2 μg RNA進行反轉錄，采用LightCycler 480 SYBR Green Master Mix體系進行PCR擴增：5 min 95 ℃；95 ℃ 10 s變性，60 ℃ 20 s退火，72 ℃ 20 s延伸，循環42次。引物序列如下：Ⅲ型膠原上游5’-AAGGCTGCAAGATGGAT GCT-3’，下游5’-GTGCTTACGTGGGACAGTCA-3’；α-SMA上游5’-GTCCCAGACATCAGGGAGTAA-3’，下游5’-TCGGATACTTCAGCGTCAGGA-3’；GAPDH上游5’-ACTCCACTCACGGCAAATTC-3’，下游5’-TCTCCATGGTGGTGAAGACA-3’。采用2-ΔΔCt法計算目的mRNA的相對表達量。

1.7 Smad信號通路蛋白表達的Western blot檢測采用SDS裂解液裂解細胞，使用BCA 蛋白檢測試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)進行定量。蛋白質樣品(50 μg)通過 SDS-PAGE進行分離，然后將蛋白轉移到Immobilon-FL轉移膜(Millipore,美國)。采用 50 g/L脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃孵育過夜。采用二抗羊抗鼠IgG(1∶100 000稀釋)孵育，DAB顯色。采用Image Lab軟件進行條帶分析，內參為GAPDH，結果取目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.8 統計學處理采用SPSS 23.0進行數據分析。所有觀察指標的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組成纖維細胞增殖活性及PCNA、Ⅲ型膠原、α-SMA蛋白表達水平的比較結果見圖1、2和表1。TGF-β1組成纖維細胞增殖活性及PCNA、Ⅲ型膠原、α-SMA蛋白表達水平均高于對照組，而CRAMP組上述指標均低于TGF-β1組。

表1 各組成纖維細胞增殖活性及PCNA、Ⅲ型膠原、α-SMA蛋白表達水平的比較

A:對照組；B：TGF-β1組；C：CRAMP組；紅色表示PCNA，藍色表示細胞核

2.2 各組成纖維細胞Ⅲ型膠原和α-SMA mRNA表達水平的比較TGF-β1組成纖維細胞Ⅲ型膠原和α-SMA mRNA表達水平高于對照組，而CRAMP組Ⅲ型膠原和α-SMA mRNA表達水平低于TGF-β1組，見表2。

表2 各組成纖維細胞Ⅲ型膠原和α-SMA mRNA表達水平的比較

2.3 各組成纖維細胞Smad信號通路蛋白表達水平的比較TGF-β1組成纖維細胞p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表達水平高于對照組，而CRAMP組上述指標均低于TGF-β1組，見圖3、表3。

A:對照組；B：TGF-β1組；C：CRAMP組；紅色表示Ⅲ型膠原，綠色表示α-SMA，藍色表示細胞核

A:對照組；B：TGF-β1組；C：CRAMP組

表3 各組成纖維細胞Smad信號通路蛋白表達水平的比較

2.4 Smad抑制劑阻斷CRAMP的作用觀察SIS3組、CRAMP+SIS3組Ⅲ型膠原和α-SMA蛋白和mRNA的表達水平均低于TGF-β1組，見圖4、表4。

A:TGF-β1組；B：SIS3組；C：CRAMP+SIS3組；紅色表示Ⅲ型膠原，綠色表示α-SMA，藍色表示細胞核

表4 3組成纖維細胞Ⅲ型膠原和α-SMA表達水平的比較

3 討論

心臟纖維化是心臟損傷、心肌梗死和其他心臟病共同的病理重塑過程。心臟纖維化破壞心臟中的心肌細胞和非心肌細胞的通訊和功能，導致收縮功能障礙和心律失常。以往研究[2,10]發現CRAMP能夠改善心肌梗死后的心功能惡化。CRAMP能夠減輕壓力負荷誘導的心肌重構，改善心功能[11]。但是CRAMP對心肌纖維化的作用仍不清楚。本研究發現CRAMP能夠直接作用于心肌成纖維細胞，抑制其活化增殖和膠原蛋白的合成，從而遏制心肌纖維化的發展。

在心臟中，心臟成纖維細胞可以分化為具有收縮、遷移和分泌特性的成肌纖維細胞。成肌纖維細胞轉分化是心臟纖維化的標志，肌成纖維細胞是成纖維細胞的活化形式[12]。α-SMA表達于成肌纖維細胞的收縮束中，是其分化的主要特征，后者增加細胞的收縮功能。成纖維細胞分化為成肌纖維細胞受多種生長因子和細胞因子的控制[13]。早期研究[8,14]表明在血管緊張素Ⅱ誘導的小鼠心力衰竭模型中，CRAMP可以抑制心臟纖維化的發展。但是其是否能夠直接作用于成纖維細胞尚不清楚。我們的研究發現小鼠重組CRAMP蛋白可抑制TGF-β1誘導的心臟成纖維細胞激活和增殖，減弱其分泌膠原的能力。

TGF-β1是TGF-β超家族的重要成員，其復雜的信號通路具有多種作用，可參與調控多種生物學功能，例如細胞生長、分化、凋亡、運動和侵襲、組織重塑、血管生成和免疫反應[14]。早期TGF-β1信號功能異常發現于腫瘤細胞中，這些功能異常在腫瘤進展中起關鍵作用[2]。隨后，研究者[2]發現TGF-β1是主要的纖維化介質，在纖維化的發展中起著重要的作用。本研究采用TGF-β1作為刺激因子，發現CRAMP能夠抑制經典的TGF-β1-Smad纖維化通路。TGF-β1結合于成纖維細胞表面的TGF-β1受體，導致細胞質內的Smad2和Smad3磷酸化，p-Smad2和p-Smad3共同結合于Smad4形成蛋白復合體，轉移至細胞核內，直接調控膠原蛋白的轉錄[15]。本研究發現CRMAP可減少心臟成纖維細胞中Smad2和Smad3的磷酸化，降低Smad4蛋白表達水平，當采用Smad3抑制劑時，CRAMP的抗纖維化作用被消除。因此Smad信號通路是CRMAP在心臟成纖維細胞中的作用靶點。

綜上所述，CRAMP能夠直接作用于心臟成纖維細胞，抑制其激活和增殖，減弱其分泌Ⅲ型膠原和α-SMA的能力，抑制TGF-β1-Smad纖維化通路。