在線固相萃取UHPLC-MS/MS法測定水中15種抗生素

吳 斌，蘇宇亮，胡克武，郝怡菲，袁漢鴻，吳 杰

(珠海水務環境控股集團有限公司，廣東珠海 519020)

近年來，抗生素在水源水中的頻繁檢出及其對飲用水生物安全的潛在風險備受關注。抗生素(antibiotics)指由細菌、霉菌或其他微生物在生活過程中所產生，具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產物，能干擾或抑制致病微生物的生存，廣泛地應用于人類及動物的疾病防治、農業生產、畜牧及水產養殖等領域。抗生素的大量使用必然會導致過多的殘留物進入到環境中，目前抗生素產生的環境危害愈發突出。因此，抗生素的生態環境效應日益受到廣大環境領域學者的關注[1-2]。研究指出，中國地表水環境中能檢測到6類共68種抗生素[3]。很多國家和地區如美國、法國、日本[4-6]，以及國內的珠江水系、北京的清河水等都有抗生素檢出[7-8]。

抗生素污染對飲用水水源安全造成了嚴重的威脅，在飲用水處理工藝中對抗生素的去除研究越來越受關注。張靜等[9]從水廠常規處理工藝、深度處理工藝兩部分介紹近幾年國內外水廠處理含抗生素原水的方法及效果，此外，還從活性炭池中微生物的抗藥性與耐氯性、消毒副產物以及給水管網3方面來論述處理含抗生素水體對給水廠的影響。結果表明，在傳統工藝中，混凝沉淀是去除抗生素的主要工藝，對喹諾酮類、磺胺類、四環素類抗生素去除率可達到50%～60%，且可通過調節混凝劑投加量、添加助凝劑PAM等方式增強混凝效果；紫外與氯消毒聯合使用時對易光解抗生素的去除效率可達到30%～50%。臭氧氧化和活性炭池等深度處理工藝亦會促進抗生素的去除，但受臭氧投加量、接觸時間等因素影響顯著，且抗生素會增強炭濾池和管網中微生物的抗藥性及耐氯性；在采用NaClO作為消毒劑時可能會促進毒性較高的氯代/溴代消毒副產物生成。此外，殘留抗生素會消耗管網中的余氯，還會促進機會病原體的出現，增加飲用水安全風險[9]。張國芳[10]對比分析了新型處理技術對抗性基因的去除現狀，研究總結出超濾膜技術對病原體的去除率高達90%～100%，多用于取代傳統的去除工藝，缺點是不能完全去除游離的抗生素抗性基因(ARGs)，且膜結垢和更換需要的成本較高。光(UV、日光)催化技術對抗生素抗性菌(ARB)和ARGs在較短時間內的去除效率也較高，可降低ARB的抗生素耐受性，缺點是會引入新的污染物，如較難去除的納米材料等。聯合技術可有效滅活ARB和去除ARGs，可完全去除ARGs，有效控制水平基因轉移風險，缺點是需較高的消毒劑投加量，UV燈管的更換帶來高額成本。

抗生素濫用會帶來極大的危害[11]，且水中目標化合物濃度通常為痕量級，因此，迫切要求開發一種快速準確的抗生素檢測技術來監測環境水中的抗生素含量。水中抗生素的傳統檢測方式是微生物法[12]，而目前測定抗生素常用的方法主要有液相色譜法[13]和液相色譜-串聯質譜法[14-15]。液相色譜法測定易受雜質干擾，靈敏度低；而液相色譜-串聯質譜法具有高效分離、靈敏度高、檢測快速、定性與定量檢測于一體等優點，已成為近年來痕量殘留檢測技術的主流方向。由于抗生素在地表水中的含量為痕量級別，富集方法也尤為重要，但是一般文獻中水樣富集使用的固相萃取技術操作比較復雜，需要使用獨立的固相萃取儀，萃取后再轉移至液相色譜-串聯質譜儀檢測[16-17]，這種固相萃取具有耗時長、操作復雜、溶劑浪費等缺點。本研究使用在線固相萃取技術，自動進樣器取5 mL水樣在線固相萃取、凈化、洗脫后直接進入液相色譜-串聯質譜儀檢測，無需二次轉移，具有操作簡便、回收率高、分析時間短、節約溶劑的優點。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

甲醇：色譜純；乙腈：色譜純；甲酸：質譜純；脫溶劑氣：高純氮(99.999%)；碰撞氣：高純氬(99.999%)。

抗生素標準品：6類15種抗生素標準樣購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度要求大于97%。分別為磺胺類(磺胺甲惡唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪)、大環內酯類(紅霉素、羅紅霉素)、四環素類(四環素、金霉素、土霉素、強力霉素)、β-內酰胺類(青霉素 G)、喹諾酮類(氧氟沙星、恩諾沙星)、氯霉素類(氯霉素)。

1.1.2 儀器

液相色譜-串聯三重四極桿質譜儀(Waters公司Xevo TQ-S Micro)。離子源：電噴霧離子源(ESI)；色譜柱：ACQUITY HSS T3柱，2.1 mm×50 mm，顆粒粒徑為1.8 μm；針式過濾器：聚偏氟乙烯(PVDF)，孔徑為0.22 μm。

1.2 液相色譜條件

色譜流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈/甲醇=90/10；柱溫為35 ℃；進樣體積為5 mL。色譜流動相梯度設置如表1所示。

表1 色譜流動相梯度設置Tab.1 Gradient Setting for Chromatographic Flow Phase

1.3 質譜條件

電離源：電噴霧正離子模式；毛細管電壓：1.5 kV；源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：550 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h。采用質譜多重反應監測模式(MRM)，質譜質量條件參數如表2所示。

表2 抗生素的質譜參數Tab.2 Mass Spectrum Parameters for Antibiotics

1.4 標準系列的配制

標準儲備溶液：分別稱取每種待測組分標準品約0.010 0 g(精確至0.000 1 g)，用甲醇溶液定容至10 mL棕色容量瓶中，此標準溶液質量濃度為1 000 μg/mL，置于-18 ℃冰箱避光保存。分別吸取15種抗生素的標準儲備液100 μL，用甲醇定容至100 mL容量瓶，配制成質量濃度為1 μg/mL的混合標準儲備液。吸取1 μg/mL的混合標準儲備液100 μL，用甲醇定容至10 mL容量瓶，配制成質量濃度為10 μg/L的混合標準工作液，在4 ℃冰箱中保存。

分別取10 μg/L的混合標準工作液25、50、100、250、500、1 000 μL，加純水20 mL后加甲酸50 μL調節pH，再用純水定容到50 mL的容量瓶，得到15種抗生素質量濃度為5、10、20、50、100、200 ng/L的標準系列。

1.5 樣品處理

1.5.1 樣品采集

用清洗干凈并干燥的棕色玻璃瓶或聚四氟乙烯(全氟丙烯)瓶采集水樣。采集時應注滿容器，上部不留空間。樣品在4 ℃避光冷藏保存，12 h內測定。

1.5.2 樣品前處理

用玻璃注射器抽取水樣，經PVDF濾膜過濾，用甲酸調節pH值為2～3。

1.5.3 在線固相萃取

利用在線固相萃取HLB小柱富集前處理后的樣品，在線固相萃取流動相A為2% NH4OH溶液；流動相B為0.5%甲酸溶液；流動相C為乙腈/甲醇=90/10；流動相D為甲醇/乙腈/丙酮=1/1/1。在線固相萃取流動相梯度設置如表3所示。

表3 在線固相萃取流動相梯度設置Tab.3 Gradient Setting for Online Solid-Phase Extraction Flow Phase

2 結果與討論

2.1 樣品測定及結果

將預處理后的樣品采用在線固相萃取，進樣量為5 mL，按照儀器分析條件進行測定，質譜多反應監測(MRM)模式采集。進樣質量濃度為50 ng/L時的色譜圖檢測結果圖1所示。

圖1 15種抗生素(50 ng/L)100%歸一化色譜圖Fig.1 100% Normalized Standard Ion Chromatogram of 15 Antibiotics (50 ng/L)

2.2 標準曲線和檢測限

取6個20 mL進樣瓶分別取1.4小節中的標準系列，然后在線固相萃取后進樣測定，以色譜峰面積進行定量，得到該檢測方法的線性回歸方程、相關系數及檢測限(以3倍信噪比計算)等參數(表4)。

表4 檢測標準曲線和檢測限Tab.4 Detection Standard Curve and Detection Limit

2.3 精密度、實際水樣和水樣加標回收率的檢測

以某地區出廠水、管網水、地表水為實際水樣，50 ng/L的抗生素混標進行加標回收分析，測定該方法的精密度和加標回收率(重復7次)，結果如表5所示。

表5 實際水樣加標回收率和相對標準偏差(n=7)Tab.5 Recovery Rate and Relative Standard Deviation of Real Samples (n=7)

2.4 實際水樣檢測

對某地區的出廠水、管網水、地表水進行檢測。飲用水中檢出金霉素、磺胺二甲嘧啶、強力霉素、四環素，質量濃度為0.94～2.49 ng/L，對人群健康基本沒有風險；地表水中檢測出磺胺類(磺胺甲惡唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪)、四環素類(強力霉素、四環素、土霉素、金霉素)及紅霉素，質量濃度為2～27 ng/L，其中河水中檢測抗生素的情況顯著多于水庫。

3 結論

(1)本文采用在線固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法，對水中15種抗生素進行痕量分析，15種抗生素在5～200 ng/L或5～50 ng/L時具有良好的線性關系，相關系數均大于0.990 0，方法的檢出限(3倍信噪比)為0.74～3.28 ng/L，加標回收率在49.6%～130.2%。

(2)該方法具有操作簡便、靈敏度高、回收率高、分析時間短、節約溶劑等特點，能夠滿足水中抗生素的監測需要。

(3)本研究采集南方某地區生活飲用水及水源水進行了15種抗生素的檢測，發現抗生素偶有檢出但含量極低，對人群健康基本沒有風險。