CRISPRi 技術沉默MRP1 基因表達增強A549/DDP 細胞對TSN 的敏感性

孟令雪，郭旭，孫新迪，沈洋，張偉偉，2，楊清竹，2，邵淑麗，2

（齊齊哈爾大學 1.生命科學與農林學院，2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

肺癌是最常見的癌癥類型之一.2020 年，全球約有1 930 萬例新癌癥病例，1 000 萬例癌癥死亡病例.肺癌的新發病例排第二位（11.4%），約有180 萬人因肺癌死亡（18%），其是癌癥死亡的主要因素[1].在肺癌治療中，化學療法被認為是所有階段的重要治療手段[2]，但不可避免癌細胞出現耐藥性，進而導致化療失敗.多藥耐藥（MDR）常見的機制是癌細胞中ATP 結合盒（ABC）外排轉運蛋白的過表達.多藥耐藥相關蛋白1（MRP1）是第一個被發現的ABCC 亞家族轉運蛋白，也被稱為ABCC1[3]，它是一個在人體組織中廣泛表達的谷胱甘肽轉運泵，通過將GSH 和化療藥物一同泵出細胞外發揮了保護細胞的作用[4-5].已有研究證實，MRP1的過表達會導致肺癌[6]、上皮性卵巢癌[7]、乳腺癌[8]、原發性神經母細胞瘤[9]等腫瘤細胞產生耐藥性，進而影響患者的化療效果.因此，干擾MRP1的表達是逆轉癌細胞耐藥性的關鍵環節.

成簇的規則間隔短回文重復序列（CRISPR）-Cas（CRISPR 相關蛋白）是一種原核適應性免疫系統，只存在于細菌及古生菌中，在真核生物及病毒中未發現.目前使用最廣泛的是可用于編輯人類基因組的釀膿鏈球菌Ⅱ型CRISPR/Cas9[10].CRISPRi 工具采用滅活的Cas9（dCas9），其上的2 個核酸酶域發生突變，會與DNA 結合，但不具有DNA 切割活性.因此，該方法可以抑制基因轉錄，導致基因沉默[11].目前，應用CRISPRi 技術逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的研究已經逐漸深入[12].

本研究利用CRISPRi 技術構建MRP1干擾表達載體，沉默A549/DDP 細胞內MRP1基因的表達，檢測其對川楝素敏感性的變化，為肺癌耐藥性逆轉提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺癌A549 細胞株，人肺癌順鉑耐藥株A549/DDP 細胞（北京腫瘤生物中心）；川楝素（南通飛宇生物科技有限公司）；RPMI-1640 培養基干粉（Gibico 公司）；胎牛血清（以色列Biological Iudustries）；質粒pSPgRNA（Genscript 公司（Scotch Plams USA），由實驗室前期保存）；E.coliDH5α，質粒快速小量提取試劑盒，UNIQ-10 柱式總RNA 提取試劑盒，M-MuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒，全蛋白提取試劑盒，DNA Marker（1Kb），蛋白Marker，吖啶橙，EDTA（上海生工生物工程股份有限公司）；Power SYBR?Green PCR Master Mix 試劑盒（Bioteke Corporation）；MRP1，β-actin一抗，羊二抗（美國LI-COR 公司）.

1.2 實驗方法

1.2.1 CRISPRi 技術構建MRP1干擾表達載體 根據靶點預測網站（http://zifit.partners.org///www.ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx）對MRP1基因啟動子區進行靶位點預測，結合轉錄因子預測軟件（http:genomatix.de/en/index.html）預測的MRP1啟動子上節能結合的轉錄因子確定3 個CRISPRi 干擾位點（見表1），每個片段的5′加BbsⅠ酶切位點序列送sangon 合成.

表1 靶向MRP1 啟動子的3 個CRISPRi 干擾位點

1.2.2 細胞培養 在37 ℃，5% CO2與飽和濕度環境下的細胞培養箱中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養人肺癌A549 和A549/DDP 細胞，根據細胞生長狀態進行傳代及后續處理，并收集細胞樣品用于實驗.

1.2.3 qRT-PCR 檢測MRP1mRNA 的表達 收集各組細胞，使用Trizol 法提取總RNA，用TOYOBO 反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，以cDNA 為模板，用TAKARA 熒光定量試劑盒進行qRT-PCR，反應體系為：5 μL 染料、2.5 μL 水、上下游引物共1 μL，cDNA 1.5 μL.選用GAPDH為內參，上游引物序列為：5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，下游引物序列為：5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′.MRP1上游引物序列為：5′-GGGGTCCTCATTATCTTCTGG-3′，下游引物序列為：5′-TGGTCTCAGGGTAGGGGTTAG-3′.所得結果以2-△△Ct方法計算mRNA 相對表達量.

1.2.4 Western blot 檢測MRP1 蛋白表達 將細胞接種到6 孔板中，待細胞生長到對數期，將干擾載體轉染進細胞中培養48 h，RIPA 裂解液提取總蛋白，SDS-PAGE 電泳后將蛋白樣電轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶封閉1.5 h，MRP1 一抗（均按1∶500 進行稀釋）4 ℃孵育過夜，PBST 洗膜3 次，兔二抗（1∶1 000稀釋）室溫避光孵育1 h，PBST 洗膜3 次，用Odyssey IR 成像儀避光掃描蛋白條帶，數據使用ImageJ 進行分析處理.

1.2.5 MTT 法檢測細胞藥物敏感性 收集A549/DDP、轉染無關對照組及sgRNA-MRP1-2 組48 h 后的細胞，用完全培養液將收集到的細胞制成單細胞懸液并計數，按照每孔5×105個的密度接種到96 孔板中，分別加入濃度為0，20，40，60，80，100 nmol/L 的川楝素作用24 h，在每孔中加入20 μL 5 mg/mL 的MTT繼續培養4 h，每孔加入180 μL DMSO，輕輕晃動后，靜置15 min.在單波長570 nm 處測定光吸收值，計算各藥物濃度下的細胞存活率，確定IC50值.細胞存活率（%）=實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%.

1.2.6 激光共聚焦檢測人肺癌A549/DDP 細胞凋亡 取對數生長期的細胞，傳代至裝有蓋玻片的6 孔板中，細胞數達到一定量時，采用PEI 轉染法轉染Scrambled 及sgRNA-MRP1-2 重組載體48 h 后，加入終濃度為60 nmol/L 的川楝素繼續培養48 h.再用1 mL 預冷PBS 洗滌細胞，用1 mL 甲醇固定30 min，滴加200 μL吖啶橙，使吖啶橙覆蓋所有細胞，用鑷子將玻片取出，倒扣在處理干凈的載玻片上，用藍色光激發，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態并拍照.

1.2.7 統計學處理 實驗數據以均數±標準差（ˉx±s）表示，用SPSS 25 軟件分析，采用Graphpad Prism 5軟件作圖.使用student t 檢驗進行組間比較.

2 結果與分析

2.1 CRISPRi 技術構建MRP1 干擾載體

根據MRP1基因啟動子序列，設計合成3 對CRISPRi 片段，定向克隆到pSPgRNA 載體上，重組載體測序結果見圖1.由圖1 可見，重組干擾載體序列與預期完全一致，3 種靶向MRP1干擾表達載體構建成功.

圖1 MRP1 基因重組質粒測序圖譜

2.2 qRT-PCR 和Western Blot 檢測干擾載體對MRP1 基因表達的影響

轉染干擾載體后，細胞中MRP1基因的表達見圖2～3.與A549/DDP 細胞相比，各重組載體轉染組細胞中MRP1基因的mRNA 和蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05）.其中轉染sgRNA-MRP1-2 重組質粒的細胞沉默效果最顯著，MRP1mRNA 和蛋白的表達水平分別降低了59.3%，42.4%（P<0.05）.

圖2 各組細胞MRP1 mRNA 和蛋白表達情況

2.3 轉染后細胞對藥物敏感性變化的影響

順鉑對各組細胞的IC50值（見表2）顯示，與A549/DDP 細胞相比，轉染sgRNA-MRP1-2 組的IC50顯著降低（P<0.001），無關對照組與A549/DDP 組無顯著差異，表明沉默MRP1基因后細胞對川楝素的敏感性增強.

表2 各組IC50值

2.4 激光共聚焦顯微鏡下細胞形態

激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態（見圖4）.由圖4 可見，未轉染組與轉染無關序列組，細胞均輪廓清晰，且鏡下細胞數量較多，未出現明顯凋亡特征.轉染sgRNA-MRP1-2 組細胞部分發生破碎、邊緣化，視野下細胞總數大量減少.

圖4 TSN 處理48 h 后顯微鏡下細胞形態變化

3 結論與討論

成功構建3 種靶向MRP1干擾表達載體并沉默A549/DDP 細胞中MRP1的基因表達，在60 nmol/L 的川楝素作用下，細胞凋亡程度增加，提高了細胞對川楝素的敏感性.

腫瘤的發生率和死亡率逐年上升，大多數肺癌患者發現時已是中晚期.除了早期手術之外，化療是腫瘤治療的重要手段，化療效果不理想的主要原因之一是腫瘤細胞的多藥耐藥，腫瘤細胞的多藥耐藥的產生是一個非常復雜且相關因素較多的過程.導致肺癌多藥耐藥的因素中，P 糖蛋白（P-gp）和MRP 蛋白家族如MRP1的高表達是導致肺癌細胞產生多藥耐藥的重要原因之一.這些外排泵蛋白會將藥物泵出細胞外，降低了細胞內的藥物濃度，從而使細胞產生耐藥性.如利用RNAi 技術沉默MRP1基因，逆轉了肝細胞癌的多藥耐藥[13].因此，調節MRP1基因的表達有可能成為逆轉癌癥耐藥并提高化療成功率的有效策略之一[14-15].

CRISPRi 技術基于一個無核酸酶活性的dCas9 蛋白，其失去切割DNA 的活性，但仍保留結合DNA 的能力.當dCas9 被引導到某個基因的轉錄起始位點TSS（transcription start site）時，dCas9 能夠物理性地阻礙RNA 聚合酶的通過，由此導致基因沉默，因此相較于RNAi 技術，CRISPRi 技術能抑制指定基因的轉錄起始，其擁有比RNAi 更高的干擾效率和更低的脫靶風險，在基因干擾能力上要優于傳統RNAi 技術.

川楝素是從楝樹根皮提取到的一種四環三萜類化合物[16].川楝素抗腫瘤的研究最早是由G R Pettit從楝科植物中提取的化合物對小鼠P388淋巴細胞白血病細胞系增殖的抑制作用[17].最近的研究發現，川楝素具有廣譜抗腫瘤效果，能抑制多種腫瘤細胞的增殖，如肺癌A549細胞、白血病HL-60細胞和肝癌Hep3B細胞等[18-20].但其作為一種藥物制劑，在作用的同時也會受到細胞耐藥性的影響.本實驗是在沉默MRP1基因的基礎上，再加入60 nmol/L的川楝素作用于細胞，檢測沉默MRP1對人肺癌A549/DDP細胞的藥物敏感性和細胞形態的影響.結果與對照組相比，轉染后加藥組的藥物敏感性顯著增加，激光共聚焦顯微鏡下觀察到細胞由梭形變為橢圓形等凋亡現象，說明干擾MRP1基因的表達，可逆轉人肺癌耐藥株A549/DDP細胞的耐藥性，有效提升腫瘤細胞的藥物敏感性.本研究結果可為川楝素在腫瘤臨床治療中研發應用提供實驗依據.