紅果參果化學成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

黃春躍，馬夢潔，牛莉鑫，靳建杰，吳 蔓，田 蓓，胡 曉,

（1.中國醫藥工業研究總院，上海 201203；2.上海醫藥工業研究院有限公司，創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 201203；3.貴州創興農業發展有限責任公司，貴州銅仁 554300）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是以多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，分為1 和2 型糖尿病。其中2 型糖尿病（type two diabetes mellitus，T2DM）是糖尿病的主要類型，占糖尿病發病率的90%～95%[1]。受不健康的飲食結構和生活方式等因素的影響，全球糖尿病的發病率不斷攀升，預計2030 年達到5.78 億例，2050 年達到7 億例[2]，已經成為繼心血管疾病和癌癥之后，威脅人們生命的第三大殺手[3]。

α-葡萄糖苷酶抑制劑能抑制人類小腸粘膜刷狀緣上的α-葡萄糖苷酶對碳水化合物的轉化，從而降低餐后血糖，是治療2 型糖尿病的重要靶點之一[4]。目前臨床上用于治療2 型糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要包括阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇三種[5]，但是這些藥物也會引起患者諸如腹瀉、腹痛、腸胃脹氣等不良反應[6]。天然來源的α-葡萄糖苷酶抑制劑一直是近年來研究的熱點，國內外學者已經從天然植物中提取到多種能夠抑制α-葡萄糖苷酶活性的化合物，如多酚[7-9]、多糖[10-12]、黃酮[13-15]、生物堿和萜類[16]等。同時研究人員發現黑醋栗、藍莓、藍果忍冬、桑椹等小型漿果對α-葡萄糖苷酶抑制活性顯著[17-18]，是天然的α-葡萄糖苷酶抑制的良好來源。

紅果參為桔梗科金錢豹屬植物長葉輪鐘草Campnumoea lancifolia（Roxb.）Merr.的根，其性平、味甘、微苦，具補虛益氣、祛痰止痛功效，主要用于勞倦氣虛乏力，跌打損傷和腸絞痛[19]。長葉輪鐘草的果實即紅果參果為小型漿果，普遍作為水果使用，具有滋補，保健等功效[20]。少量研究文獻報道顯示紅果參果富含黃酮類、多糖類以及酚酸類等化學成分[21]，具有清除羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH 等自由基的作用，有較好的體外抗氧化作用[22-25]。

目前紅果參從野生到規范化種植，并在我國西南地區作為經濟水果規模種植，帶動了當地的扶貧產業和經濟發展。但對紅果參果化學成分和生物活性研究相對薄弱，制約了其開發和利用，而關于紅果參果的α-糖苷酶抑制活性和潛在抗糖尿病作用未見報道。本研究以人工規模栽培的紅果參果為研究對象，制備兩種提取物，并對其多糖、總黃酮、總花色苷、總多酚等大類成分含量進行測定。通過UPLC-QTOFMS 技術對其化學成分表征和結構鑒定，并對紅果參果提取物樣品以及其代表性成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性考察。旨在對紅果參果資源的開發利用提供更多的科學實驗依據和數據支撐，為天然來源的α-糖苷酶抑制劑的發現提供更多選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5 批紅果參鮮果（批號1-A-7，2-A-9，3-B-11，4-A-12 和5-B-5）采摘時間2021 年3 月8 日，貴州創興農業發展有限責任公司；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷 批號ST04290120MG，純度≥98.0%，上海詩丹德技術有限公司；對硝基苯-α-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyran oside，pNPG）批號C12462390，純度99%，上海麥克林生化科技有限公司；α-葡萄糖苷酶 批號SLBT8587，酶活力18.5 U/mg（G5003-100UN），美國Sigma 公司；阿卡波糖水合物 批號G1718046，純度≥98%，阿拉丁試劑（上海）有限公司；黨參炔苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、蘆丁、木犀草素、芹菜素 實驗室自制對照品；乙腈 質譜級；其他試劑 均為分析純。

ZG TP101 電子分析天平 松竫精密天平；PHS-3C pH 計 上海精密科學儀器有限公司；UV-2600紫外-可見分光光度儀 SHIMADZU；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學儀器有限公司；BUCHI Lyovapor? L-200 冷凍干燥機 瑞士步琦有限公司；梅特勒MS105DU 電子天平 梅特勒·托利多公司；KQ-250DE 型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Waters ACQUITY UPLC I-Class 串聯Xevo G2-XS QTOF 質譜儀 美國沃特世公司；Sigma 1-14k 離心機 美國Sigma 公司；EPOCH 酶標儀 美國Bio-Teck 公司；Minipore 純化水系統 德國Merck 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅果參果乙醇提取物的制備 參考宛美志等[26]的方法稍作修改。稱取5 批等質量的紅果參鮮果（約100 g）于燒杯中，用料理機勻漿，按照料液比1:10（g/mL）加入含0.1%鹽酸的65%乙醇水溶液，保鮮膜封口，水浴溫度40 ℃，提取120 min，過濾，濾液轉入旋轉蒸發儀濃縮除去乙醇，濃縮液冷凍干燥得紅果參果乙醇提取物，分別記為批號1-A-7、2-A-9、3-B-12、4-A-12 和5-B-5，密封，避光貯存在-80 ℃冰箱中，備用。

1.2.2 紅果參果粗多糖的制備 參考陳莉華等[22]的方法稍作修改。稱取5 批等質量的紅果參鮮果（約100 g）于燒杯中，用料理機粉粹勻漿，按照料液比1:20（g/mL）加入去離子水，保鮮膜封口，熱水超聲（功率250 W，頻率40 kHz，80 ℃）提取三次，每次45 min，提取液過濾，合并濃縮至一定體積，加入四倍量無水乙醇，過夜，離心（轉速5000 r/min）15 min，冷凍干燥得紅果參果粗多糖。

1.2.3 紅果參果粗多糖含量測定 以硫酸-苯酚法顯色[23]，紫外可見分光光度法測定紅果參粗多糖多糖含量。

稱取干燥至恒重的葡萄糖，配制成100 μg·mL-1標準使用液。分別移取0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL標準使用液置于10 mL 刻度管中，補充蒸餾水至1.0 mL。分別加入苯酚試劑1.0 mL，搖勻，于冷水浴中緩緩加入3.0 mL 硫酸，立刻搖勻。靜置5 min 后，置于沸水浴加熱15 min，取出后立即以流水冷卻至室溫。以相應試劑為空白，在λ=488 nm 處以紫外可見分光光度計測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，葡萄糖溶液濃度（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線y=47.6125x-0.0818（R2=0.9925）。

取1.2.2 項下的紅果參果粗多糖約10 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加水至刻度線，搖勻。精密量取0.1 mL，照標準曲線的制備項下的方法，自“補充蒸餾水至1.0 mL”起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的濃度，計算出紅果參果粗多糖中多糖含量。

1.2.4 紅果參果乙醇提取物黃酮含量測定 總黃酮的測定采用硝酸鋁-亞硝酸鈉法[27]測定。

精密稱取蘆丁對照品10 mg，置10 mL 量瓶中，用70%乙醇溶解后并稀釋定容，搖勻，即得1 mg/mL的蘆丁對照品溶液。精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、1.6、2.0 mL，分別置25 mL 量瓶中，各加50%乙醇溶液補足至6 mL，再分別加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加4%氫氧化鈉溶液10 mL后再加水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min。以相應的試劑為空白對照，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在510 nm 的波長處下測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標，蘆丁溶液濃度C（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線：y=12.0350x-0.0136（R2=0.9996）。

取紅果參果乙醇提取物0.2 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 Hz）15 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取濾液3 mL，置25 mL 容量瓶中，再加入50%乙醇溶液3 mL 照標準曲線的制備項下的方法，自“加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL”起，依法測定吸光度，從標準曲線中讀出供試品溶液中蘆丁濃度，再換算成提取液中總黃酮的質量，計算紅果參果乙醇提取物中總黃酮含量。

1.2.5 紅果參果乙醇提取物總花色苷含量測定 采用pH 示差法，參考文獻[28-31]的方法。取紅果參果提取物約50 mg，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，用0.1%鹽酸甲醇溶液溶解并定容，作為供試品溶液。

取供試品溶液兩份各1 mL，分別用pH1.0 的氯化鉀緩沖溶液和pH4.5 的乙酸鈉緩沖溶液稀釋至10 mL，混勻后于室溫條件下靜置反應30 min，分別在波長520 和700 nm 處，用1 cm 比色皿測定吸光度，重復操作3 次，取平均值。按照下列公式計算總花色苷的含量：

式中：ΔA 為緩沖液稀釋后的吸光度；V 為花色苷供試品溶液體積，mL；n 為稀釋倍數；M 為矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾質量，449.2 g/mol；ξ為矢車菊-3-葡萄糖苷消光系數，26900 L/（mol·cm）；m 為稱取樣品質量，g；b 為比色皿厚度，cm。

1.2.6 紅果參果乙醇提取物總多酚含量測定 參照譚曉舒等[32]的方法并做適當修改。

標準曲線制作：精密稱取沒食子酸10 mg，用乙醇溶解后用蒸餾水定容至10 mL，配制成1 mg/mL標準儲備液。準確移取沒食子酸標準儲備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 和0.8 mL，用乙醇溶液稀釋成質量濃度為10、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL的溶液。吸取對照品溶液各0.5 mL 于10 mL 比色管中，先后加入2.5 mL 稀釋10 倍的福林酚試劑（0.1 mol/L）、2.0 mL 7.5%的碳酸鈉溶液，充分混勻，黑暗處反應1 h，用紫外可見分光光度計在765 nm波長處測定吸光度值，吸光值（A）為縱坐標，以沒食子酸濃度（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線：y=0.0055x-0.1363（R2=0.9996）。同樣吸取樣品溶液0.5 mL，依法測定，根據標準曲線計算供試品溶液中的總酚含量，結果表示為沒食子酸（gallic acid equivalents，GAE）當量濃度即μg（GAE）/mL，進一步計算出樣品中的多酚含量。

1.2.7 紅果參果乙醇提取物的化學成分鑒定 通過實驗室前期的質譜色譜條件優化，采用UPLC-QTOFMS 技術對紅果參果乙醇提取物進行化學成分分析。

供試品溶液制備：取紅果參果乙醇提取物適量，精密稱定，置入25 mL 具塞錐形瓶中，精密加入含1%甲酸的甲醇溶液10 mL，密塞，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率40 Hz）30 min，放冷，再稱定重量，用相應溶劑補足減失的重量，搖勻，濾過。

對照品溶液配制：取黨參炔苷、木犀草苷、蘆丁、木犀草素和芹菜素的對照品適量，用甲醇配制成混合標準備品溶液，備用。

UPLC 條件：Waters ACQUITY I-class 超高效液相色譜儀；Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相系統：0.1%甲酸水（A）:乙腈（B）；流速：0.30 mL/min；洗脫程序：0～1 min，98% A；1～15 min，98%～80% A；15～20 min，80%～69% A；20～28 min，69%～58% A；28～35 min，58%～20% A；35～38 min，20% A；38～41 min，20%～0 A；柱溫：35 ℃；進樣量：1.0 μL。

MS 條件：Waters Xevo G2-XS QTOF 質譜儀，離子源為電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI）；正、負離子掃描模式，飛行時間質量分析器；源電壓：2.5 kV（-），3.0 kv（+）；碰撞氣體為氮氣，N2流速：800 L/h；毛細管溫度400 ℃；錐孔氣體流速：100 L/h；氣源溫度：120 ℃；采用全掃描方式，質量掃描范圍50～1500 Da；碰撞誘導解離電壓：6 V（低能量）、30～60 V（高能量）

1.2.8α-葡萄糖苷酶活性測定α-葡萄糖苷酶活性參考文獻[33-34]方法測定略作改動。在96 孔板中加入各樣品溶液10 μL 和0.2 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液60 μL，于37 ℃搖床中孵育10 min，再加入2.0 mmo/L 的pNPG 溶液80 μL，繼續37 ℃搖床中孵育20 min 后立即用0.2 mol/L 的Na2CO3溶液50 μL 終止反應，于405 nm 波長處測定吸光度值A，每個樣品平行測定3 次。以阿卡波糖為陽性對照，按照抑制率（%）=[1-（A 樣品組-A 樣品空白組）/（A 陰性組-A 空白組）]×100，計算抑制率，并用SPSS18.0 軟件求出相應的IC50值。樣品溶液包括紅果參果乙醇提取物樣品溶液、紅果參果粗多糖樣品溶液、木犀草素、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷和黨參炔苷溶液。

1.3 數據處理

所有實驗均重復操作3 次，采用Excel 軟件對數據進行整理繪圖，采用SPSS18.0 計算IC50。

2 結果與分析

2.1 紅果參果樣品含量測定結果

多糖、黃酮、多酚和花色苷是植物果實的重要大類成分，因此本研究考察了紅果參果提取物中各大類成分的含量。5 批粗多糖多糖的含量分別為27.59%±1.89%、33.20%±2.62%、34.62%±2.06%、37.59%±2.34%和33.47%±2.51%，含量范圍在27.59%～37.59%，其中4-A-12 批次多糖含量最高，為37.59%；1-A-7 批次多糖含量較低，為27.59%，與其他4 批樣品存在顯著性差異（P＜0.05），紅果參果乙醇提取物的測定結果見表1。

表1 紅果參果乙醇提取物的總黃酮、總花色苷及總多酚含量（，n=3）Table 1 Contents of total flavonoids,total anthocyanins and total phenols in ethanol extracts of HGSG (,n=3)

表1 紅果參果乙醇提取物的總黃酮、總花色苷及總多酚含量（，n=3）Table 1 Contents of total flavonoids,total anthocyanins and total phenols in ethanol extracts of HGSG (,n=3)

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。

由表1 可見，不同批次紅果參提取樣品的總黃酮、總花色苷和總多酚含量存在一定的差異。5 批紅果參果提取物的總黃酮含量為1.22%～1.77%，其中5-B-5 批次黃酮含量較低，1.22%，4-A-12 批次黃酮含量最高，為1.77%；總花色苷含量為0.90%～1.14%，5-B-5 花色苷含量最低為0.90%，4-A-12 批次花色苷含量最高，為1.14%；總多酚含量在13.11～18.85 gGAE/100 g 之間，其中2-A-9 總多酚含量最低為13.11 gGAE/100 g，4-A-12 批次總多酚含量最高，為18.85 gGAE/100 g。5 批紅果參果提取物中4-A-12 批次的多糖、總黃酮、總花色苷和總多酚含量均最高，其中多酚比桑葚、藍莓及黑加侖等漿果更高，黃酮含量相當[35]；2-A-9 批次提取物與其他批次的提取物相比含量差異相對較小，因此，后續選擇來源于2-A-9 的粗多糖和乙醇提取物做后續的研究。

2.2 紅果參果乙醇提取物的化學成分結構鑒定分析

采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱，以添加0.1%甲酸的水溶液-乙腈為洗脫流動相來增加花色苷的穩定性和分離度[36]，建立UPLC-QTOFMS 分析方法。由于紅果參乙醇提取物所含化學成分在正、負離子模式下有一定差異，因此本研究在正、負離子模式下，對2-A-9 紅果參果乙醇提取物進行數據采集，其質譜基峰離子色譜圖見圖1。

采用Waters Masslynx 軟件和UNIFI 數據處理系統對質譜數據進行處理，通過精確分子量、質譜碎片裂解規律、化合物極性及保留時間分析，并結合參考文獻及對照品比對，在紅果參果乙醇提取物中共鑒定出21 個化合物，包括10 個黃酮、3 個有機酸、3 個花色苷、3 個酚酸、1 個氨基酸和1 個聚炔，見表2。從表2 中可見紅果參果實化學成分種類豐富，富含多種活性成分。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷和飛燕草素-3-O-蕓香糖苷為三種花色苷成分，已被證實具有良好的降糖活性[45-46]。鑒定的非花色苷類酚性成分以黃酮和酚酸類成分為主，其中黃酮類成分最為豐富，10 個黃酮類成分中8 個為黃酮糖苷，主要是木犀草素的糖苷類成分，糖基以葡萄糖、蕓香糖為主，同時還檢測到木犀草素和芹菜素游離的苷元。3 個酚酸類物質為咖啡酸和綠原酸類成分。這些天然來源的黃酮類物質和酚酸類物質均具有一定的降糖作用[47-49]，這為后續的深入研究提供了科學依據。此外，從紅果參果中首次鑒定出具有抗炎、抗癌等藥理活性的聚炔類黨參炔苷成分[50]。

2.3 α-糖苷酶抑制活性

本研究采用pNPG 法，以2-A-9 紅果參果乙醇提取物、2-A-9 粗多糖及其主要代表成分為代表考察紅果參果的體外α-葡萄糖苷酶抑制活性。如表3 所示，紅果參果乙醇提取物和粗多糖在2.00 mg/mL 下顯示出較強的抑制活性，抑制率在80%以上；在1.00 mg/mL 的濃度下，木犀草素對α-葡萄糖苷酶的抑制率超過90%，顯示出較強抑制活性；在1.00 mg/mL的濃度下矢車菊素-3-O-蕓香糖苷的α-葡萄糖苷酶抑制活性較弱，抑制率為30%；黨參炔苷對α-葡萄糖苷酶無抑制作用。

表3 樣品α-糖苷酶抑制活性實驗Table 3 α-Glycosidase inhibitory activity test

進一步考察紅果參果乙醇提取物、紅果參果粗多糖和代表黃酮成分木犀草素在不同濃度下的α-葡萄糖苷酶的活性抑制能力，見圖2，陽性對照阿卡波糖的抑制能力見圖3。可見各實驗樣品在一定的質量濃度（紅果參粗多糖6.72～107.5 μg/mL、紅果參乙醇提取物質量濃度2.79～89.25 μg/mL、木犀草素0.75～12.06 μg/mL）范圍內對α-糖苷酶活性的抑制呈現質量濃度依賴，隨著各樣品質量濃度的增加對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用加強。采用SPSS18.0 軟件對實驗數據進行分析，計算出實驗樣品的半數抑制濃度IC50，紅果參果乙醇提取物、粗多糖、木犀草素和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶半數抑制濃度IC50分別為7.52、37.43、8.03 和616.17 μg/mL，4 個實驗樣品對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用強度：紅果參果乙醇提取物＞木犀草素＞粗多糖＞阿卡波糖，三個樣品的抑制活性均顯著高于臨床糖尿病常用的藥物阿卡波糖（P＜0.05），紅果參乙醇提取物的IC50與木犀草素相當，約為阿卡波糖的82 倍，具有更強的抑制作用。藍莓乙醇提取物α-糖苷酶抑制活性（IC50=13.0 mg/mL），阿卡波糖（IC50=3.09±0.14 mg/mL）[51]；桑葚乙酸乙酯提取物（IC50=72.01±4.18 μg/mL），阿卡波糖（IC50=77.05±6.10 μg/mL）[52]；藍果忍冬多糖HEP-2（IC50=1.56 mg/mL），阿卡波糖（IC50=10.13 mg/mL）[53]，與這些漿果提取物相比紅果參果提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用更有優勢。

圖2 木犀草素和紅果參果樣品的α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.2 α-Glucosidase inhibition of luteolin and HGSG samples

圖3 阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.3 α-Glucosidase inhibition of acarbose

3 結論

本文采用經典的紫外分光光度法測定紅果參果乙醇提取物中總黃酮、總花色苷和總多酚等大類成分含量，進一步通過UPLC-QTOF-MS 技術對其化學成分進行分析和結構鑒定，結果顯示紅果參果乙醇提取物富含花色苷、酚酸、木犀草素及其糖苷黃酮類等多種酚類活性成分。本研究首次對紅果參果乙醇提取物和粗多糖的體外α-葡萄糖苷酶抑制活性進行考察，對紅果參果降糖作用的藥理價值進行評估。實驗結果顯示紅果參果乙醇提取物和粗多糖均對α-葡萄糖苷酶活性有良好的抑制作用，紅果參果乙醇提取物在7.52 μg/mL 質量濃度下與木犀草素（8.03 μg/mL）抑制作用相當，具有更強的α-葡萄糖苷酶抑制作用。紅果參果乙醇提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性優于粗多糖以及木犀草素、黨參炔苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷等三個不同結構類別的代表化合物，可能是多成分協同作用的結果，初步推斷黃酮類、酚酸類等酚類成分可能是紅果參果抑制α-葡萄糖苷酶活性的重要藥效物質基礎。酚類物質作為小漿果代謝過程中重要的次生代謝產物，存在于漿果的莖葉、果肉以及種皮中，其含量僅次于纖維素、半纖維素和木質素，具有多種藥理活性[54]。黃酮類化合物又是酚類中的重要組成部分，眾多研究顯示其具有良好的抗糖尿病活性作用，有望成為用于調節2 型糖尿病中的餐后高血糖更安全的替代品[55]。

本研究結果豐富了紅果參果的化學成分庫并首次報道其潛在的天然降糖能力。后續尚需要對紅果參果的α-葡萄糖苷酶的抑制類型及抑制作用機理進行深入研究，進一步明確其藥效物質成分群，為紅果參果開發為降糖功能性食品提供更多的實驗依據，為新型的天然α-糖苷酶抑制劑的開發提供新的來源。