殼聚糖涂覆磁性納米顆粒對纖維素酶的固定化

王 琳，劉容旭，劉丹怡，王語聰，韓建春,

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品研究院，黑龍江哈爾濱 150028）

纖維素酶常用于水解纖維素晶體的β-1,4 糖苷鍵以產生葡萄糖[1-2]，廣泛應用于食品、化工、洗滌劑、化妝品、紙漿、造紙和制藥等行業。然而，纖維素酶的應用經濟成本高，容易失活，且難以重復使用。這些缺點限制了其在工業中的應用，因此如何降低成本、減少酶的使用量、增加酶活性成為固定化酶領域的研究重點[3]。

近幾年，選用合適的功能化磁性納米顆粒固定酶被認為是降低成本的可行性辦法[4]。功能化磁性納米顆粒表面可以涂覆許多活性官能團，如-COOH、-NH2和-OH 等，具備與酶高效結合的能力[5]。目前，已有研究者對此展開研究，孫俊[6]以羧甲基殼聚糖為表面殼體材料制備了功能性的超順磁性納米顆粒，用于分離純化蛋清中溶菌酶，效果優于傳統溶菌酶分離純化技術。董劍[7]將四臂型聚乙二醇樹枝狀聚合物修飾在四氧化三鐵納米顆粒固定纖維素酶，與游離纖維素酶相比，固定化后的纖維素酶在熱穩定性、重復使用穩定性等方面均得到了明顯的提高。此類研究表明，改性磁性納米顆粒有利于簡化操作工藝，使用其作為載體固定酶具有研究意義及廣泛的應用前景。

如何提高酶的穩定性是固定化酶領域研究的重點。殼聚糖是一種可生物降解，具有生物活性、無毒的聚合物，在食品、化妝品、制藥和生物技術領域被廣泛應用[8-10]。磁性納米顆粒與殼聚糖的結合后，其表面的-COOH，-NH2、-OH 等基團具有與纖維素酶的N-末端共價結合的能力，多點共價連接促進了固定化酶結構的加固，從而減少外界環境的變化引起酶構象的變化，提高酶的穩定性[11-15]。因此，本實驗采用殼聚糖涂覆磁性納米顆粒，作為載體固定纖維素酶，得到的固定化纖維素酶具有更好的酸堿適應范圍、熱穩定性以及重復利用性。本文提出的酶固定化方式及殼聚糖涂覆的方法條件溫和、簡便快速，豐富了酶的固定化方式。為纖維素酶的廣泛應用提供新的技術和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

纖維素酶（30 U/mg）杰凱生物科技有限公司；四水合氯化亞鐵、六水合氯化亞鐵、環氧氯丙烷、3,5-二硝基水楊酸、殼聚糖等化學試劑 均為分析純，盛達生物科技有限公司。

FTIR-8400 傅里葉變化紅外光譜儀、ZEISS-SUP RA55 型高分辨率場發射掃描電鏡顯微鏡 德國Bruker 公司；Zetasizer NanoZS90 電位分析儀 德國蔡司公司；恒溫搖床 盛達生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Fe3O4磁性納米顆粒的制備 將FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O（Fe2+與Fe3+摩爾比為1:1.75）充分溶解至250 mL 純凈水中，500 r/min 攪拌溶解，通入N2排氧氣10～15 min，氨水調節pH＞10，攪拌10 min，80 ℃水域保溫30 min。分別用乙醇和去離子水清洗3 次，之后加入檸檬酸1 mg/mL 于95 ℃攪拌90 min，冷凍干燥24 h，4 ℃保存。

1.2.2 Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒的制備及表征

1.2.2.1 Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒的制備 將制備的Fe3O4磁性納米顆粒超聲處理8000 r/min 30 min，取1.00 g Fe3O4磁性納米顆粒置于1.5 mL 環氧氯丙烷和2 mL 磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）中，25 ℃，250 r/min搖動3 h。將活化的Fe3O4磁性納米顆粒在50 ℃，400 r/min 下繼續超聲處理30 min 后，加入殼聚糖2 mg/mL，搖床搖動12 h，在外加磁場的作用下回收Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒，并用去離子水洗滌數次，在4 ℃下儲存備用。

1.2.2.2 SEM 掃描電子顯微鏡 經干燥過篩后的Fe3O4、Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒樣品置于載物臺上，真空條件下噴金處理，將處理好的樣品放入觀察室，拍攝顆粒形貌照片[16]。

1.2.2.3 VSM 磁性能分析 采用振動樣品磁強計（VSM）表征Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒的磁性能。

1.2.2.4 FTIR 紅外光譜分析 將Fe3O4、Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒樣品在105 ℃干燥2 h 后，采用KBr 壓片法，按照1%的比例與KBr 充分混合、研磨、壓片后置于紅外光譜儀上測試。掃描范圍為400～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1，采用DTGS 檢測器，以空氣為空白，掃描64 次后取平均值得到樣品的紅外光譜圖[17]。

1.2.2.5 Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒循環利用實驗通過吸附、水洗、解吸等步驟，考察Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒循環利用對固定化纖維素酶的影響，吸附條件設為：溶液體積100 mL，Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒添加量為1 g，纖維素酶初始濃度為0.5 mg/mL，溫度50 ℃，pH6，固定化時間3.5 h。固定化完成后在外加磁場的作用下將磁性納米顆粒分離，對上清液測定蛋白質含量，用去離子水對固定纖維素酶的磁性納米顆粒進行水洗，然后直接進行解析。解吸液（0.5 mol/L NaCl 溶液，pH6 的PBS 緩沖液5 mL，解析時間為2 h。解析完成后對磁性納米顆粒用去離子水進行反復水洗，將其放入與上一組實驗相同的纖維素酶溶液中，進行第二次吸附，重復進行此實驗10 次[16]。

1.2.3 固定化纖維素酶復合體系的制備及表征

1.2.3.1 固定化纖維素酶復合體系的制備 將1 g Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒500 W 超聲處理 30 min 后與100 mL（0.5 mg/mL）纖維素酶緩沖溶液（PBS，pH6）混合，在一定溫度（45 ℃）搖床中搖動3 h 直到吸附平衡，吸附完成后，在外加磁場的作用下回收纖維素酶復合體系[18]，并分析紅外光譜。

1.2.3.2 電位分析 用Mastersizer 2000 分析儀測量Fe3O4、Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒、固定化纖維素酶復合體系的粒徑和電勢，將樣品分散于蒸餾水中，稀釋后至1 mg/L，500 W 超聲處理30 min 后進行測試[6]。

1.2.3.3 磁場輔助分離測試 將制備的固定化纖維素酶復合體系置于透明玻璃器皿中，加入一定量水，在外在磁場的作用下進行測試。

1.2.4 固定化纖維素酶酶學性質研究

1.2.4.1 固定化纖維素酶及游離纖維素酶酸堿穩定性 試驗在不同pH（2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0）下進行羧甲基纖維素水解，將5 mg 游離纖維素酶以及0.1 g 固定化纖維素酶分別加入到不同pH 的緩沖溶液中，50 ℃條件下保溫15 min 后，測定固定化纖維素酶和游離纖維素酶酶活[19]。

1.2.4.2 固定化纖維素酶及游離纖維素酶溫度穩定性 根據Sánchez-Ramírez 等[20]的方法，將游離纖維素酶和固定化纖維素酶分別置于60 和70 ℃條件下4 h，每小時檢測其活性，比較游離纖維素酶和固定化纖維素酶的熱穩定性。

1.2.4.3 固定化纖維素酶的循環利用實驗 根據Jiang 等[21]的方法測定固定化纖維素酶的可循環利用率。取一定量固定化纖維素酶于100 mL 羧甲基纖維素（CMC）水溶液（濃度為1%）中進行水解，水解完成后在外加磁場的作用下對固定化纖維素酶后的Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒進行分離，并用PBS沖洗干凈，將其重新置于新鮮的100 mL 羧甲基纖維素（CMC）水溶液（濃度為1%）開始另一個循環，共循環10 次，計算固定化纖維素酶在每個循環的相對活性，設定固定化纖維素酶的初始活性為100%，將每輪獲得的活性與首輪活性進行比較。

1.2.5 酶活性測定 為了評估游離酶和固定化酶的酶活性，設定游離纖維素酶最大酶活力為100%。固定化纖維素酶活力測定：將4 mL 緩沖溶液加入含有0.05 g 固定化纖維素酶的錐形瓶中。然后，將1 mL羧甲基纖維素鈉溶液（溶解在100 mL 緩沖溶液中的1.0 g 羧甲基纖維素鈉溶液）加入上述錐形瓶中，并將混合物在50 ℃下振蕩30 min。纖維素酶會將羧甲基纖維素鈉催化分解成葡萄糖。隨后，將固定纖維素酶的Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒在外加磁場的作用下進行移除，回收沒有纖維素酶的溶液。然后，在溶液中加入1.5 mL DNS 試劑溶液，在沸水中加熱5 min，得到有色產物，測定540 nm 處的溶液吸光度。制備不含纖維素酶的平行羧甲基纖維素鈉溶液樣品作為空白對照[22]。根據標準工作曲線計算產生葡萄糖的量。

1.3 數據處理

實驗結果采用SPSS 19.0 統計學軟件進行分析，所得數據以平均值±標準誤表示，均數組件比較采用單因素方差分析，進行組間的兩兩比較。

2 結果與分析

2.1 Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒結構表征

2.1.1 Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒SEM 掃描電鏡分析 根據掃描電鏡結果圖1a、圖1b 可知，Fe3O4磁性納米顆粒分散性較好，大小均一，外表形狀不規則，大致呈橢圓形圖1b。從圖1c 可知，涂覆殼聚糖后，其粒徑、表面形態并未發生明顯變化，但Fe3O4-殼聚糖納米顆粒分散性有所提高圖1c。當用殼聚糖涂覆后，由于表面含有帶正電荷的氨基，靜電作用使Fe3O4-殼聚糖的分散性提高，有利于固定化酶充分與底物進行接觸[22]。

圖1 Fe3O4（a、b）、Fe3O4-殼聚糖（c）的掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of Fe3O4 (a,b),Fe3O4-chitosan magnetic nanoparticles(c)

2.1.2 Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒VSM 分析 圖2顯示了室溫下殼聚糖涂覆之前和之后的磁性納米顆粒的磁滯回線，Fe3O4的飽和磁化強度為6.16 emu/g，Fe3O4-殼聚糖的飽和磁化強度為5.17 emu/g，殼聚糖的涂覆并沒有影響磁性納米顆粒的磁性，圖中顯示磁性納米顆粒的起始磁化曲線與退磁曲線重合，沒有磁滯壞現象出現，即兩條曲線的矯頑力（Hc）和剩磁（Mr）均趨向于零，這是超順磁性納米材料的特殊性質[23]。表明Fe3O4、Fe3O4-殼聚糖具有超順磁性，能夠在外加磁場的作用下進行固液分離，外磁場消失后磁性納米顆粒不會有剩磁，能夠重新分散在溶液中，這種性質也使得磁性納米顆粒在進行定向靶藥的過程中不會出現堵塞血管的問題[24]。

圖2 Fe3O4 磁性納米顆粒、Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒的磁滯回線Fig.2 Magnetization hysteresis loops for Fe3O4,Fe3O4-chitosan magnetic nanparticles

2.1.3 Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒FTIR 分析 圖3為Fe3O4，Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒的FTIR 譜圖，用于表述殼聚糖涂覆磁性納米顆粒的機理。Fe3O4磁性納米顆粒光譜圖在583 cm-1處出現了Fe-O 的特征吸收峰。Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒光譜圖與磁性納米顆粒的光譜圖相似，但是在3500 cm-1處出現-OH 特征吸收峰，1386 cm-1處出現殼聚糖中-COOH的特征吸收峰，1078 cm-1處出現C-O-C 的特征吸收峰，1650 cm-1處出現的吸收峰歸因于N-H 的彎曲振動。此外，Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒光譜圖在3500 cm-1處出現的-OH 特征吸收峰峰寬有所減少，可能是磁性納米顆粒表面上的-OH 基團與殼聚糖表面的基團相互作用的結果[25]。上述試驗表明，殼聚糖與磁性納米顆粒實現了有效結合。

圖3 Fe3O4，Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒FTIR 譜圖Fig.3 FTIR spectra of Fe3O4,Fe3O4-chitosan magnetic nanparticles

2.1.4 Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒的循環利用實驗解析液（0.5 mol/L NaCl 溶液，pH=6 的PBS 緩沖溶液），隨著循環利用次數的增多，Fe3O4-殼聚糖對纖維素酶的固載量逐漸下降。在循環利用的開始階段，Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒對纖維素酶的固載量下降幅度較小，在進行第6 次循環利用試驗時，仍然能夠達到38.1 mg/g 的固載量。從第7 次循環利用試驗開始，固載能力下降明顯，但是在10 次重復試驗時仍然能達到15.7 mg/g 的固載量（圖4）。

圖4 Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒循環利用次數對纖維素酶固載量的影響Fig.4 Effect of recycling times of Fe3O4-chitosan magnetic nanoparticles on the amount of cellulase immobilized

纖維素酶在磁性納米顆粒上固載量的下降可能是因為每一次的重復利用，Fe3O4-殼聚糖表面都會有吸附位點仍然被纖維素酶所占用，因此，可以發生作用的吸附位點減少，吸附量下降。此外，解吸后溶液中的Na+和Cl-可能部分殘留在吸附劑表面，從而影響到下一次循環中的吸附效果[26]。Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒的可重復利用性為工業應用節約成本提供了新方法。

2.2 固定化纖維素酶復合體系表征

2.2.1 FTIR 紅外圖譜 如圖5 所示，固定了纖維素酶的Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒在1635 cm-1處出現的N-H 鍵的彎曲振動吸收峰強度減弱，可能是Fe3O4-殼聚糖通過靜電相互作用以及離子鍵結合，使其表面的-COOH 和纖維素酶N-末端（-NH2）之間形成了酰胺鍵（特別是 C-O 轉換成C-N）。1035 cm-1處吸收峰的出現可能由于纖維素酶蛋白鏈的羰基與殼聚糖涂覆的納米顆粒的羥基之間的相互作用，3500 cm-1處吸收峰由于Fe3O4的-OH 與纖維素酶中的-OH、N-H 的吸收峰的疊加而變寬[27]。結合Fe3O4-殼聚糖以及固定化纖維素酶磁性納米顆粒的FTIR 圖譜，發現衍射峰強度發生了變化，說明纖維素酶與Fe3O4-殼聚糖之間存在著相互作用力，該結果表明纖維素酶固定化成功。

圖5 Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒、纖維素酶復合體系的FTIR 光譜圖Fig.5 FTIR spectra of Fe3O4-chitosan magnetic nanoparticles,cellulase complex system

2.2.2 Zeta 電位及粒徑分析 磁性納米顆粒本身具有比表面積大，表面能高等性質，因此比較容易團聚。從結果上看，在其表面涂覆殼聚糖之后，其粒徑有所增加。吸附酶后表面粒徑進一步增加，可能是由于納米顆粒表面電勢以及顆粒間排斥力降低，沒有外力的作用下更容易團聚[28]。

通過電位分析，Fe3O4磁性納米顆粒表面上存在很多負電荷，電勢為-32.2 mV。涂覆殼聚糖和固定化纖維素酶之后電勢有所上升，分別為-15.2 和0.36 mV（表1）。這可能是由于磁性納米顆粒依次與殼聚糖、纖維素酶結合，使得Fe3O4磁性納米顆粒表面的-COOH、-OH 等帶電基團減少，從而導致電勢上升。該結果進一步證明了Fe3O4磁性納米顆粒與殼聚糖、纖維素酶之間存在相互作用[29]。

表1 Fe3O4、Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒、纖維素酶復合體系的粒徑和電勢Table 1 Potential and Particle size of Fe3O4,Fe3O4-chitosan magnetic nanoparticles,cellulase complex system

2.2.3 磁場輔助納米顆粒分離情況 在從圖6 可以看出，固定纖維素酶前后的Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒在水溶液中分散均勻，在外加磁場的作用下，可以快速向磁場方向聚集圖7a、圖7b，顯示出較強的磁響應性。經過對Fe3O4，Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒，纖維素酶復合體系的磁回收時間進行測試，結果分別為5.5、5.8、20.3 s，表明Fe3O4磁性納米顆粒具有較好的磁響應性能，能夠在外加磁場的作用下實現快速回收，涂覆殼聚糖后，對其磁性能幾乎沒有影響，而在固定化纖維素酶后Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒的回收時間顯著增加，但是仍然能夠在混合體系中實現快速分離，符合固定化酶載體的要求，可以為工業應用節約大量時間。

圖6 Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒（a）、纖維素酶復合體系（b）在水溶液中的分散穩定性Fig.6 Dispersion stability of Fe3O4-chitosan magnetic nanoparticles(a)，cellulase complex system(b) in water solution

圖7 磁場輔助分離水溶液中固定化纖維素酶的Fe3O4-殼聚糖納米顆粒的示意圖Fig.7 Schematic diagram of magnetic field assisted separation of Fe3O4-chitosan nanoparticles immobilized with cellulase in aqueous solution

2.3 固定化纖維素酶酶學性質研究

2.3.1 固定化纖維素酶及游離纖維素酶酸堿穩定性分析 穩定性對于工業應用非常的重要，圖8 顯示的是pH 對游離和固定纖維素酶活性的影響，與游離纖維素酶相比較，固定纖維素酶在強酸性環境和強堿性環境中均表現出較高的活性。游離纖維素酶在pH 為3～7 范圍內有較好的活性，固定纖維素酶在pH 為2～9 范圍內均有較好的活性。當pH 為2 時，固定化酶活性下降程度低于游離纖維素酶，pH 為10 時，游離纖維素酶幾乎喪失全部活性，而固定化纖維素酶活性為33.84%，仍表現出一定的活性。

圖8 pH 對游離纖維素酶和固定化纖維素酶的影響Fig.8 Effects of pH on free cellulase and immobilized cellulase

總體來看，在不同pH 條件下，與游離纖維素酶相比，固定化纖維素酶穩定性得到了提高，適用范圍更廣泛，這可能是由于酶與磁性納米顆粒結合引起凈電荷增加[30]，同時磁性納米顆粒涂覆后，有利于保護酶表面的水化層，避免了酶的失活，在固定化后，酶的結構更加穩定[31]。試驗結果與Ying 等[32]研究結果一致，結果表明使用磁性納米顆粒固定化后增強了纖維素酶的酸堿穩定性。

2.3.2 固定化纖維素酶及游離纖維素酶溫度穩定性分析 圖9 表示固定纖維素酶和游離纖維素酶的熱失活（在60 和70 ℃）的情況，結果表明，固定化酶比游離纖維素酶更加穩定，通過溫度效應，固定化纖維素酶更加不容易失活，在放置于60 ℃條件下4 h 后，游離纖維素酶活性連續降低，最終僅達到初始活性的40%，并且放置于70 ℃條件下3 h 后因為變性而幾乎完全失去活性。而固定化纖維素酶在60 和70 ℃下4 h 后，仍然能保持將近50%的活性。

圖9 游離纖維素酶和固定化纖維素酶的溫度穩定性Fig.9 Thermal stability of free cellulase and immobilized cellulase

固定化纖維素酶的高穩定性可歸因于其與磁性納米顆粒載體的共價連接導致自由度的降低，因此避免了分子間的聚集，其結構獲得了更高的剛性，致使在更高溫度下運行穩定性的提高[33]。

2.3.3 固定化纖維素酶的可循環利用性 游離纖維素酶只能夠用一次，酶固定化的優點之一就是重復使用性，在固定化纖維素酶的可循環利用性實驗中，經過10 次循環使用后，纖維素酶仍然保持在52.6%的高活性，表明固定在磁性納米顆粒上的纖維素酶的儲存穩定性明顯高于游離酶的穩定性。酶活性的下降可能是由于纖維素酶復合體系組成的損失，終產物抑制和蛋白質降解[27]。另外固定化纖維素酶可能在攪拌過程中從納米顆粒上脫落，在剛開始的7 次循環利用中，酶活性相對穩定，活性可達83.1%，從第八個循環開始，纖維素酶活性開始大幅度下降（圖10），可能是由于磁性納米顆粒物理吸附纖維素酶出現部分解吸。Alahakoon 等[34]使用固定在磁性納米顆粒上的酶在進行10 個循環羧甲基纖維素水解后得到了高達30%的初始纖維素酶活性。與先前報道的結果相比，本研究中測試的酶制劑具有更好的重復使用性。從結果中觀察到，固定化纖維素酶的長期穩定性和可重復使用性使其更適用于工業中。

圖10 循環利用次數對纖維素酶活性的影響Fig.10 Effect of recycle number on cellulase activity

3 結論

本研究利用掃描電鏡觀察磁性納米顆粒在涂覆殼聚糖前后的變化，利用振動磁場計檢測磁性納米顆粒涂覆殼聚糖前后磁性變化情況，Fe3O4、Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒均具有較好的磁響應性，矯頑力（Hc）和剩磁（Mr）趨向于零，符合超順磁性納米材料的特殊性質。運用紅外光譜儀檢測磁性納米顆粒表面化學基團的變化，以證明涂覆過程中接枝成功。運用Zeta-電位檢測殼聚糖前后顆粒表面的電荷變化情況。檢測了Fe3O4-殼聚糖磁性納米顆粒的可重復利用性，在進行第6 次循環利用試驗時，仍然能夠達到38.1 mg/g 的固載量。同時研究發現，相比游離纖維素酶，固定化酶表現出更高的酸堿穩定性，在pH2～9范圍內均有較好的活性。熱穩定性也更好，在60和70 ℃下4 h 后，仍然能保持將近50%的活性。固定化酶經過10 次循環使用后，仍然保持在52.6%的高活性。以上試驗結果表明，以殼聚糖涂覆磁性納米顆粒作為載體固定化纖維素酶，明顯提高了酶的使用效率和穩定性，實現纖維素酶的循環使用，為固定化酶技術的進一步改良和發展提供了理論依據及實際應用前景。