超聲處理對紅豆蛋白理化性質及抗氧化功能的影響

安 宇，周欣雨，王 穎,2,3,，佐兆杭，孫 維，張乃丹，龐惟俏

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室，黑龍江大慶 163319）

紅豆（Vigna angularis）是豆科植物的一種，又稱為小豆、赤豆等[1]。紅豆營養價值較高，蛋白平均含量為25.2%，富含膳食纖維，礦物質和維生素種類豐富[2]，氨基酸種類齊全，必需氨基酸水平達到甚至高于FAO/WHO 的要求[3]。此外，其還具有的較高藥用價值，如滋脾、益氣、抗氧化和抑制腫瘤細胞增長等，同時可作為糖尿病患者食用的優選[4]，研發應用前景極為廣闊。

雖然紅豆蛋白營養豐富，但由于其乳化性等功能特性較差[5]，限制了其在食品工業的應用，因此，適度的改性處理可擴展紅豆蛋白在食品工業中的應用[6]。目前有關紅豆蛋白的改性方法有堿溶酸沉法、微射流、微波等方法。例如周偉等[7]研究指出，在pH＞5 的堿性條件、較低溫度和NaCl 低濃度環境下均能提高小豆蛋白的功能特性。黃科禮等[5]采用微射流方法對紅豆分離蛋白進行改性處理繼而增強紅豆蛋白理化與功能特性。但化學改性可能會產生或引入有毒物質或影響食品風味的物質，微波改性收益較低、成本較高。相較之下，超聲波作為被公認為一項綠色技術，具有操作簡單、實施方便[8]、成本低、能耗低[9]等優點。已有相關研究報道，超聲處理可改變豌豆蛋白[10]、大豆蛋白[11]乳化性等功能特性，但目前關于利用超聲技術，研究不同超聲條件及超聲前后對紅豆蛋白理化性質及抗氧化能力影響的研究較少。因此，本研究以紅豆蛋白為原料，研究了超聲前后及不同超聲參數工藝對紅豆蛋白理化性質及抗氧化能力的影響，以期為紅豆蛋白的開發應用提供相應的數據支持，具有現實理論意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂紅豆蛋白（蛋白質量分數90%）三原天域生物制品有限公司；5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）、乙二胺四乙酸 上海碧云天生物技術有限公司；甘氨酸 上海吉至生化科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷天津光復科技發展有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）美國Sigma 公司；T-AOC 試劑盒、鐵離子還原力試劑盒 上海博湖生物科技有限公司；以上試劑 均為分析純。

AR2140 電子天平 常州勵岸寶機械設備科技有限公司；DL-360B 型超聲波清洗機、FD-1A-50 型冷凍干燥機、JIDI-18D 型臺式多用途高速離心機上海之信儀器有限公司；UV759 型紫外分光光度計 愛來寶醫療科技有限公司；PHS-3CpH 計 上海精密科學儀器有限公司；NLM100 均質機 上海人和科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅豆蛋白的超聲處理 參考Tomotake 等[12]的方法制備樣品，略有改動。取20 g 脫脂紅豆蛋白粉分散在100 mL 蒸餾水中并攪拌均勻。參考文獻[13-14]設置超聲功率為160、400 W，超聲時間為10、20、30 min，將蛋白溶液分別上述條件下進行超聲處理。超聲功率160 W 設為A 組，400 W 設為B組，樣品分別標記為A1、A2、A3、B1、B2、B3?？瞻讓φ諡椴贿M行超聲處理的干燥紅豆蛋白粉。超聲結束后，將樣品平鋪放入容器中，-80 ℃冰箱冷凍12 h后，凍干機干燥成粉末，于4 ℃冰箱密封保存。

1.2.2 紅豆蛋白水解度測定 利用鄰苯二甲醛（OPA）法對紅豆蛋白進行水解度[15]測定。用紫外可見光分光光度計測定其吸光度（340 nm），注意OD 值要在精確反應2 min 后進行測定。按照下列公式進行計算：

式中：h 表示水解的肽鍵數；hhot表示總肽鍵數；SerineNH2表示mmol SerineNH2/g 蛋白；α、β分別用常數1.00、0.40 表示；X 表示待測樣重量（g）；P 表示待測樣中的蛋白含量（g/mL）；0.1 為待測樣體積轉換成L[16]。

1.2.3 紅豆蛋白溶解度測定 采用雙縮脈試劑法測量蛋白的溶解度[17]。同理測定總蛋白濃度，溶解度定義為上清液中蛋白濃度與總蛋白濃度的比值。

1.2.4 紅豆蛋白游離巰基與二硫鍵含量測定 游離巰基含量：將10 mmol/L 5,5′-二硫代-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）溶解在0.1 mol/L Tris -甘氨酸緩沖液（2.5%SDS，0.004 mol/L EDTA，0.09 mol/L 甘氨酸，0.086 mol/L Tris，pH8.0）中得到Ellman’s 試劑。取50 μL DTNB緩沖液與2 mL 濃度為0.01 g/mL 的樣品溶液混合，25 ℃避光反應30 min，紫外分光光度計測定吸光度（412 nm），以緩沖液為空白。

總巰基含量：將適量的蛋白質樣品溶解于尿素-Tris -甘氨酸緩沖液（10 mol/L 尿素，2.5% SDS，0.004 mol/L EDTA，0.09 mol/L 甘氨酸，0.086 mol/L Tris，pH8.0）和β-巰基乙醇（β-Me；加入50 μL），搖勻后在25 ℃暗室孵育60 min。8000 r/min 離心20 min，將得到的上清溶于5 mL 濃度為12% 的TCA（w/v）中，重復3 次。離心后將沉淀溶解于2.5 mL 的Tris-甘氨酸溶液中，加入50 μL DTNB，25 ℃避光孵育30 min。最后，用紫外分光光度計在412 nm 處測量吸光度。巰基含量的計算公式如下：

式中：A412表示樣品在412 nm 處減去空白后的紫外吸光度值；D 表示樣品稀釋倍數；C 為樣品濃度（g/mL）。

1.2.5 紅豆蛋白乳化性及乳化穩定性測定 乳化性及乳化穩定性的測定參考Wu 等[18]報道的方法。計算公式如下：

式中：θ表示乳化液中的油相體積分數（25%）；A0表示0 min 時混合液的吸光度值；A1表示0 min時混合液的吸光度值。

1.2.6 紅豆蛋白起泡性及起泡穩定性測定 配制100 mL 蛋白質量分數為5%的蛋白分散液，8000 r/min轉速下均質2 min（每20 s 停頓20 s，共均質6 次），快速轉入量筒中記錄剛轉入量筒的泡沫體積V總，并分別記錄在2、30 min 時的泡沫體積為V0、V30。

1.2.7 紅豆蛋白抗氧化能力測定

1.2.7.1 紅豆蛋白總抗氧化能力測定 取0.5 g 紅豆蛋白加入50 mL 去離子水中，混合均勻。采用TAOC 試劑盒測定，結果表示為U/g。

1.2.7.2 紅豆蛋白DPPH 自由基清除能力測定 參考張雪春等[19]的方法，略有改動。以無水乙醇為溶劑，配制濃度為2×10-4mol/L 的DPPH 溶液，于4 ℃冰箱備用。各加入0.5 mL 不同濃度的樣品到4 mL的2×10-4mol/L DPPH 自由基溶液，搖勻室溫下靜置30 min。517 nm 下測定其吸光值A；同時測定4 mL 2×10-4mol/L DPPH 自由基溶0.5 mL 的60%乙醇混合液的吸光值Ac，計算公式如下:

1.2.7.3 紅豆蛋白鐵離子還原能力測定 取0.5 g 紅豆蛋白加入50 mL 去離子水中，混合均勻。使用鐵離子還原力試劑盒測定。

1.3 數據處理

實驗均進行三次重復，結果以平均±標準偏差表示。利用Excel、SPSS 22.0 等進行數據的處理和分析，采用Origin 2018 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 超聲處理對紅豆蛋白水解度的影響

超聲前后對紅豆蛋白水解度的影響如圖1。超聲前后紅豆蛋白的水解度差異顯著（P＜0.05）。超聲功率400 W 處理20 min（B2）時，紅豆蛋白的水解度達到最大值21.3%。杜雙奎等[20]研究表明，由于超聲處理產生的空化效應會使蛋白質結構發生改變，蛋白質中活性部位暴露進而增加了水解度。但當超聲功率不變，時間繼續增加時，水解度開始下降。分析是因超聲過度使暴露在外的蛋白質活性部位被破壞，導致水解度開始降低[21]。所以，適度超聲處理可提高紅豆蛋白水解度。

圖1 不同超聲條件對紅豆蛋白水解度的影響Fig.1 Effects of different ultrasonic conditions on the degree of protein hydrolysis of adzuki bean

2.2 超聲處理對紅豆蛋白溶解度的影響

溶解度是蛋白質的重要性質之一[22]。如圖2，與空白對照相比，超聲處理顯著提高（P＜0.05）了紅豆蛋白溶解度，且隨超聲功率與時間增加而升高，當超聲功率400 W 處理20 min（B2）時紅豆蛋白的溶解度達到最大值76.65%。刁小琴等[23]研究指出，超聲產生的空化作用和機械效應會將蛋白質大分子解聚為小分子，從而降低蛋白質粒徑，增強蛋白質與水的相互作用，使蛋白質溶解度增加。劉昕等[24]研究表明，由于超聲波使鷹嘴豆蛋白發生輕微變性，使蛋白結構疏松，疏水肽數量增加，從而使蛋白質溶解度提高。Zhong 等[25]指出，在不同溫度不同時間加熱對紅豆蛋白溶解度沒有太大的影響，相反，在熱與超聲共同作用下，隨著處理溫度和時間的增加，溶解度逐漸增加，所以認定超聲是蛋白溶解度增加的主要原因。所以，合理范圍的超聲處理可顯著（P＜0.05）提高紅豆蛋白的溶解性。

圖2 不同超聲條件對紅豆蛋白溶解度的影響Fig.2 Effects of different ultrasonic conditions on solubility of adzuki bean protein

2.3 超聲處理對紅豆蛋白游離巰基與二硫鍵含量的影響

不同超聲條件對紅豆蛋白中游離巰基與二硫鍵含量變化如圖3 所示。由圖3 可知，超聲處理使蕓豆蛋白中游離巰基含量顯著增加（P＜0.05），二硫鍵的含量顯著降低（P＜0.05）；與空白對照相比，當超聲功率400 W 處理20 min（B2）時游離巰基含量最高，增加了3.12 μmol/g，超聲功率400 W 處理30 min（B3）時二硫鍵含量最低，減少了1.35 μmol/g。趙城彬等[26]研究發現，超聲處理5 min 時就可發現紅豆蛋白中游離巰基含量顯著增加（P＜0.05）。這是由于超聲波產生的空化作用使蛋白質分子的顆粒減小，蛋白質內基團發生了改變[27]。研究表明，超聲波破壞蛋白質內二硫鍵，分解成為新的游離巰基[28]。推測本實驗中超聲處理造成蛋白質內部巰基的暴露與二硫鍵的斷裂，降低了蛋白質分子穩定性，從而導致紅豆蛋白中游離巰基含量增加，二硫鍵含量減少。但當超聲條功率400 W 處理30 min（B3）時，蛋白中游離巰基的含量開始減少。這是因為超聲時間過長會產生過氧化氫，使游離巰基被氧化，進而降低游離巰基含量[29]。

圖3 不同超聲條件對紅豆蛋白游離巰基與二硫鍵含量的影響Fig.3 Effects of different ultrasonic conditions on content of free sulfhydryl group and disulfide bond in adzuki bean protein

2.4 超聲處理對紅豆蛋白乳化性及乳化穩定性的影響

乳化性代表蛋白質在水和油界面的吸附能力，而乳化穩定性是蛋白質在乳化液儲存并留在油水界面的能力。乳化穩定性越高，則表示乳化性質越好[30]。如圖4 所示，超聲處理顯著提高（P＜0.05）了紅豆蛋白的乳化性及乳化穩定性，當超聲條功率400 W 處理10 min（B1）時紅豆蛋白乳化性及乳化穩定性達到最佳，與空白對照相比，分別提高了78.62%、43.94%。但當超聲功率不變，時間繼續增加時，乳化性及乳化穩定性開始顯著下降（P＜0.05）。這是由于超聲時間過長使蛋白質嚴重變性，被解聚成小顆粒的蛋白質重新聚集成大顆粒，從而降低它的乳化性[31]。楊柳等[32]研究發現，在設置功率240 W、時間10 min的超聲處理下，紅豆蛋白的乳化活性顯著增強（P＜0.05），但當超聲時間大于20 min 時，紅豆蛋白乳化活性減弱。望運滔等[33]研究指出，超聲處理會使鷹嘴豆分離蛋白的乳化性顯著提高（P＜0.05）。所以，合理范圍的超聲處理能夠顯著增加（P＜0.05）紅豆蛋白乳化性及乳化穩定性。

圖4 不同超聲條件對紅豆蛋白乳化性及乳化穩定性的影響Fig.4 Effects of different ultrasonic conditions on emulsification and stability of adzuki bean protein

2.5 超聲處理對紅豆蛋白起泡性及起泡穩定性的影響

由圖5 可知，超聲處理顯著增加（P＜0.05）了紅豆蛋白起泡性及起泡穩定性。當超聲條功率400 W處理10 min（B1）時紅豆蛋白的起泡性及起泡穩定性分別達到最大值160.94%、74.37%。分析是超聲處理產生的空化作用使蛋白質分子聚集程度減小而松散，使得蛋白質更易吸附在氣-水界面上，增加了紅豆蛋白的起泡性及起泡穩定性[34]。Xiong 等[35]表明了超聲處理10 min 以上可顯著增加豌豆蛋白的起泡性。望運滔等[33]研究到隨著超聲強度的增加，鷹嘴豆蛋白的起泡性顯著增強（P＜0.05），超聲處理20 min時，起泡性達到最大值。因此，適當的超聲處理能夠有效的提高紅豆蛋白的起泡性及起泡穩定性。

圖5 不同超聲條件對紅豆蛋白起泡性及起泡穩定性的影響Fig.5 Effects of different ultrasonic conditions on foamability and foamability stability of adzuki bean protein

2.6 超聲處理對紅豆蛋白抗氧化能力的影響

紅豆蛋白的抗氧化能力如圖6 所示，超聲前后蛋白抗氧化能力差異顯著（P＜0.05）。在超聲條功率160 W 處理30 min（A3）時紅豆蛋白總抗氧化能力最強，與空白對照相比增加了101.58%；DPPH 自由基清除能力與Fe 離子還原能力在超聲條功率400 W處理10 min（B1）時達到最大值，與空白對照相比分別增加了78.23%、33.52%。Penta 等[36]發現蛋白質的抗氧化能力主要與組氨酸以及疏水性氨基酸有關，而賈俊強等[37]研究表明，超聲波處理會加速蛋白質疏水性氨基酸外露。由此說明，超聲處理可增加蛋白質的疏水性氨基酸基團數量，從而增加紅豆蛋白的抗氧化能力。You 等[38]研究指出超聲處理使紅豆蛋白中含有的類似于組氨酸、蘇氨酸等非特異性蛋白暴露在蛋白表面的數量增多，這些非特異性蛋白能夠將Fe3+還原成Fe2+，從而提高紅豆蛋白的Fe 離子還原能力。當超聲功率不變，時間繼續增加時，蛋白的三種抗氧化能力指標數值開始下降，推測是因超聲時間過長，暴露氨基酸基團重新被掩埋，樣品抗氧化能力降低。

圖6 不同超聲條件對紅豆蛋白抗氧化能力的影響Fig.6 Effects of different ultrasonic conditions on antioxidant capacity of adzuki bean protein

3 結論

與空白對照相比，超聲處理可以顯著增強（P＜0.05）紅豆蛋白的溶解度、水解度、乳化性及乳化穩定性、起泡性及起泡穩定性，超聲處理使游離巰基含量增加，二硫鍵含量減少，且紅豆蛋白抗氧化能力的三種指標均顯著提高（P＜0.05）。但超聲過度時，紅豆蛋白的理化性質數值與抗氧化能力均會下降，因此，適度的超聲處理可以使紅豆蛋白理化性質及抗氧化能力提高。本研究為進一步探討超聲處理對紅豆蛋白的理化性質及抗氧化能力奠定基礎，為紅豆等雜糧的開發與利用提供了理論依據。