基于Illumina Miseq 測序技術分析剁辣椒產地預加工過程中菌群變化

陳夢娟，蔣立文,2, ，劉 洋，王蓉蓉，周 輝,2，趙玲艷，覃業優

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128；3.湖南壇壇香生物科技有限公司，湖南長沙 410128）

辣椒（Capsicum annuumL.）為木蘭綱茄科辣椒屬草本植物果實，原產于南美洲的熱帶地區。目前，辣椒已成為世界上最重要的農業經濟作物之一，尤其是在中國和墨西哥[1]。而中國是世界上第一大辣椒生產國和消費國[2]。辣椒自明朝傳入我國以來，其接受程度、加工方式和食用方法逐步形成了地域性差異。剁辣椒是湖南的特色辣椒加工產品，傳統加工一般是以新鮮紅辣椒為原料，經清洗、晾干、去梗、剁碎，拌料及密封鹽漬發酵而成的產品，以香辣咸鮮而著名。

近年來，我國剁辣椒產業的發展趨勢穩定，產業產值穩步增加，但其產業的發展卻受到許多限制。首先，我國辣椒的主產區集中于山東、河北、山西等地北方地區，但南方地區才是主流的消費地區[3-5]。由于新鮮辣椒果實的含水量較高，采收后辣椒易霉爛變質，且在運輸過程中還存在自然蒸發脫水引起的果實失重、失鮮、機械損傷以及生理性病害等問題[6]，損耗大，進而導致剁辣椒的生產成本升高。其次，由于辣椒為季節性蔬菜，因此生產時還需要考慮原料的季節性問題。此外，剁辣椒產業的發展還受到制作工藝與加工機械的限制。為了產業鏈對接緊密，一般剁辣椒加工采取異地收購辣椒并產地腌漬處理，再輸送到生產企業加工等待發酵和加工，鹽漬辣椒半成品更便于運輸及貯藏，滿足維持工廠全年生產的需求。因此，產地處理效果好壞直接影響到產品品質。

目前，剁辣椒廠家在辣椒產地預加工方式是以18%～25%的鹽度鹽漬新鮮紅辣椒制成大量的鹽漬辣椒半成品，裝袋密封備用。但絕大部分廠家在產地加工過程中存在生產工藝落后、經驗性加工、原料未清洗、粗放管理、添加劑使用不規范等問題[7]，直接影響鹽漬辣椒半成品的質量與產品的后續生產。此外，高鹽鹽漬辣椒在后續生產時需進行脫鹽處理，產生大量高鹽廢水，給環保帶來極大壓力。隨著人們對食品安全和環境保護的高度重視，產地加工的衛生加工條件引起生產企業的極大關注。并且根據國家對農產品加工環節減損增效的要求[8]，辣椒產地加工必將成為未來的發展趨勢。因此，對辣椒產地加工工藝優化、建立標準化管理、辣椒保脆保鮮方法研究和配套加工設備優化等方面的研究顯得尤為重要。剁辣椒生產中最重要的鹽漬辣椒半成品的產地預加工環節缺乏加工方法考察、配套設備適用性考察、技術規范、食品安全性以及產品品質變化等多方面的研究。

目前，規范企業在產地加工標準化、連續化方面做了大量的工作，也開發非標準設備包括：分選、清洗、振動脫水、分流斬拌、分級、拌料、包裝等連續性較強的半自動化生產線，但具體控制要求尚不明晰。本文針對不同產地鹽漬辣椒半成品產地預加工過程中影響品質和安全的生物學問題開展研究，采用Illumina MiSeq 高通量測序技術對山東、山西不同產地及不同品種辣椒樣品在預加工為鹽漬辣椒過程中的細菌和真菌菌群進行分析，考慮辣椒產地預加工中關鍵的工藝步驟對微生物的影響，探討加工過程中的工藝合理性和科學性，為提升產地加工水平以及工藝及設備改進提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮辣椒 源于山東曹縣和山西忻州辣椒種植加工基地，品種分別是線椒和朝天椒。樣品采集時間為2020 年9 月中旬，兩種紅辣椒均為新鮮、成熟狀態。樣品采集見表1；平板計數瓊脂培養基（PCA 培養基）、孟加拉紅瓊脂培養基 廣東環凱微生物科技有限公司；食品級焦亞硫酸鈉 山東凱龍化工科技發展有限公司；異抗壞血酸鈉 湖南明瑞祥盛貿易有限公司；檸檬酸 山東顧誠化工科技有限公司；食鹽中鹽皓龍鹽化有限責任公司；Pusion Hot start flex 2X Master Mix 上海儀濤生物儀器有限公司；DL2000 DNA Maker 寶日醫生物技術（北京）有限公司；Gene colour 核酸染料 北京金博益生物技術有限公司；Qubit dsDNA HS Assay Kit 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Biowest Agarose G-10 西班牙BIOWEST；50×TAE Buffer 上海生工生物工程股份有限公司；AxyPrep PCR Cleanup Kit AXYGEN 美國Bio-Rad Laboratories Inc.；Soil DNA Kit 美國OMEGA bio-tek Inc.。

表1 產地加工辣椒樣品采集信息Table 1 Collection information of processed pepper samples from origin

5424 型常溫離心機 Eppendorf Centrifuge；Microfuge 22R 型冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；WH-861 型旋渦震蕩儀 太倉市華利達實驗設備有限公司；A200 型PCR 儀 杭州朗基科學儀器有限公司；MiSeq pe300 測序儀 Illumina 公司；Tanon-2500 型凝膠成像儀 上海天能科技有限公司；JY300 型電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司；DW-HL388 型超低溫冷凍儲存箱 中科美菱低溫科技有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的處理和采集 新鮮紅辣椒經采收后送至當地工廠采用相同加工流程與機械，具體操作見圖1。取樣時間點分別為原料采收、一級清洗、二級清洗、切分過篩及拌料（鹽漬半成品）步驟，完成后立即取樣，每個環節隨機取樣4 袋，每袋1 kg，低溫保藏運輸至實驗室進行試驗。

圖1 辣椒產地預加工流程圖Fig.1 Flow chart of pepper origin pre-processing

1.2.2 細菌及真菌計數 霉菌和酵母菌的菌落計數根據GB/T 4789.15-2016 進行操作[9]；菌落總數的測定則根據GB 4789.2-2016 進行操作[10]。進行微生物計數時，每個樣品設置4 個重復。

1.2.3 細菌16S rDNA 序列及ITS 2 序列分析 使用OMEGA 的土壤DNA 提取試劑盒對各關鍵工序的辣椒樣本的總DNA 進行提取，提取步驟均按照試劑盒說明書完成，然后將總DNA 加入到50 μL 緩沖液中并儲存在-80 ℃備用。

擴增細菌16S rDNA V3～V4 區域。引物為：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。PCR 擴增體系：25 μL 包含DNA 模板25 ng、上下游引物各為2.5 μL、12.5 μL PCR 預混合物。PCR 擴增條件：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環35 次；最后72 ℃延伸10 min。

擴增真菌ITS 2 區所選用的引物為：ITS1FI2（5'-GTGARTCATCGAATCTTTG-3'）和 ITS2（5'-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3'）。PCR 體系為25 μL包含DNA 模板25 ng、上下游引物各為2.5 μL、12.5 μL PCR 預混合物。PCR 條件：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環35 次；最后72 ℃延伸10 min。

取PCR 產物10 μL 用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將檢測合格的樣品送至杭州聯川生物技術有限公司進行高通量測序。按照生物學樣品處理基本要求，所有樣品均有4 個技術重復樣品。

1.2.4 測序數據分析 對下機數據進行拆分，使用PEAR 合并成對端讀數，對原始標簽進行質量過濾，以獲得符合FastQC（V 0.10.1）的高質量tags[11]。通過Verseach（V2.3.4）將具有97%以上相似性的序列分配給相同的可操作分類單元（operational taxonomic unit，OUT）[12-13]。利用PyNAST 軟件對不同類群優勢種群的差異進行多序列比對。以Chao 1、Shannon、Simpson 和Observed species 為指標，用QIME（1.8.0 版）計算所有樣品的各項指標并進行聚類，來分析各個樣品中的Alpha 多樣性，以及進行主成分分析和主坐標分析分析[14-16]。同時，根據每個OTU 代表序列與RDP 數據庫和Unite 數據庫的比對，得到各個樣本所有OTU 的物種注釋[17]，經分類和統計后以R 語言繪制各分類水平物種豐度表及熱圖。

1.3 數據處理

采用SPSS 22.0 的Duncan 多區間檢驗方法進行單因素方差分析。數據繪圖使用了Origin 2018。利用OmicStudio 工具進行生物信息學分析（https://www.omicstudio.cn/tool）。平均值和標準差通過使用Excel 2019 從3 個獨立實驗獲得的數據并進行計算。

2 結果與分析

2.1 線椒和朝天椒加工過程中細菌群落結構的變化

2.1.1 加工辣椒樣品細菌α-多樣性 本次16S 測序共獲得的3035040 條有效數據，進行OTU 聚類分析后兩種產地加工辣椒中的細菌群落多樣性指數結果見表2。由表2 可知，Goods coverage 指數均≥0.99，測序結果可反映樣品中細菌群落的真實情況。由α-多樣性結果可知，線椒樣品中的Observed Species顯著高于朝天椒中的（P＜0.05）。在朝天椒樣品中，根據Observed Species、Shannon 以及Simpson 指數可以看出，細菌的物種數量、豐富度及均勻度在清洗兩次的過程中呈現顯著降低趨勢（P＜0.05）。但在分切過篩的過程中Observed Species 又呈現升高的趨勢，可能與相應設備中殘留的細菌有關。而在線椒樣品中，在原料清洗經第二次后，Observed Species 和Shannon 指數均顯著上升（P＜0.05），說明線椒的第二次清洗沒有達到清洗的效果。但隨著線椒在分切過篩和拌鹽過程，Shannon 和Simpson 逐漸降低，表明在此過程中細菌菌群的豐富度和均勻度是逐漸降低的，且變化規律與朝天椒中的相似。

表2 加工辣椒樣品中細菌群落多樣性指數統計Table 2 Alpha diversity index of bacterial community in processed pepper samples

2.1.2 加工辣椒樣品細菌β-多樣性 細菌群落的主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）見圖2。由圖2 可知，朝天椒樣品點與線椒的樣品點的距離較遠，說明在兩種辣椒在相同的加工流程中細菌菌群結構差異大，這種差異主要與朝天椒（CYL）和線椒（XYL）原料所附著細菌菌群的差異相關。此外，隨著加工的進行，朝天椒樣品中的細菌菌群結構的變化明顯大于線椒樣品中的。

圖2 加工辣椒樣品中細菌群落的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of bacterial community in processed pepper samples

2.1.3 辣椒樣品中細菌物種注釋及分類 圖3A 和圖3B 分別為產地加工辣椒樣品中細菌在門水平和屬水平上的物種注釋結果。在朝天椒和線椒的樣品中門水平上共注釋到17 個菌門，主要優勢菌均為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），在所有樣品中這兩門類相對豐度之和均超過了95%。而厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）也經常作為優勢門類出現在發酵辣椒制品中[18-19]。此外，還有擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍細菌（Cyanobacteria）等。

由圖3B 可知，在屬水平上原料上優勢菌屬種類差異明顯，朝天椒原料附著的優勢菌為乳球菌屬（Lactococcus，相對豐度為14.21%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，13.30%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，12.39%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，10.37%）以及腸球菌屬（Enterococcus，11.02%）。而線椒原料表面附著的優勢菌為假單胞菌屬（Pseudomonas，18.48%）、泛菌屬（Pantoea，13.94%）、腸球菌屬（Enterococcus，13.72%）和沙雷氏菌屬（Serratia，10.36%）。

圖3 門和屬分類水平上細菌菌群相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacterial community at the phylum and genus classification level

其次，在經過兩次清洗后，朝天椒樣品中乳球菌屬（Lactococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）以及線椒樣品中的腸球菌屬（Enterococcus）的相對豐度顯著增加（P＜0.05）。但在對比CQX2 和CFQ 后發現，朝天椒樣品中乳球菌屬（Lactococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對豐度分別降低至8.19%和2.93%。線椒樣品中腸球菌屬（Enterococcus）的相對豐度也由二次清洗后的29.91%降低至14.26%，這可能與二次清洗后的振動脫水工序有關。

在朝天椒的半成品（CBY）中，叢毛單胞菌屬（Comamonas）、腸球菌屬（Enterococcus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）3 種菌屬相對豐度最高；而線椒半成品（XBY）中假單胞菌屬（Pseudomonas，23.17%）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas，23.20%）和腸球菌屬（Enterococcus，20.12%）為優勢菌，均與原料中優勢菌種類和結果有較大差異。本研究中XBY 的細菌注釋結果與趙玲艷等[20]采用454 焦磷酸測序對同品種同產地的鹽漬線椒中細菌菌群部分相似。此外，兩種辣椒樣品前30 的菌屬中，常見的乳酸菌菌屬有乳球菌屬（Lactococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc），但鹽漬半成品中乳酸菌的相對豐度均低于原料。

2.2 線椒和朝天椒產地加工過程中真菌群落結構的變化

2.2.1 產地加工辣椒樣品真菌α-多樣性 本次ITS測序共獲得的3337111 條有效數據，進行分析后兩種產地加工辣椒中的真菌群落多樣性指數結果見表3。由真菌α-多樣性的結果可知，線椒與朝天椒原料上的真菌種類數量上無明顯差異。并且兩種辣椒中真菌的Observed Species 均呈現出先降低后增高的規律，與16S 的結果呈現出的規律一致。根據Observed Species、Shannon 以及Simpson 指數可以看出，朝天椒和線椒樣品中微生物的多樣性及均勻度在第二次清洗后顯著降低（P＜0.05）。在分切過篩時，CFQ 和XFQ 樣品中真菌Observed Species 顯著高于CQX2 和XQX2 的（P＜0.05）。

表3 加工辣椒樣品中真菌群落多樣性指數統計Table 3 Alpha diversity index of fungi community in processed pepper samples

2.2.2 產地加工辣椒樣品真菌β-多樣性 在真菌群落的PCA 分析中（見圖4），兩坐標軸的貢獻率之和為70.55%。由圖4 可知，朝天椒（CYL）和線椒（XYL）原料附著的真菌也具有顯著差異（P＜0.01），但隨著加工的進行，兩種辣椒中的真菌菌群結構的差異性在逐漸的減小。

圖4 加工辣椒樣品中真菌群落的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of fungi community in processed pepper samples

2.2.3 產地加工辣椒樣品中真菌物種注釋及分類圖5A 和圖5B 分別為產地加工辣椒樣品中真菌在門水平和屬水平上的物種注釋結果。在門水平上共注釋到6 個菌門，子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）為絕對優勢菌門，所有樣品中二者相對豐度的總和均超過99.7%。此外，還檢測到接合菌門（Zygomycota）、被孢霉菌門（Mortierellomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）以及Fungi unclassified。

由圖5B 可知，朝天椒原料上真菌的優勢菌屬為擬酵母屬（Pseudozyma，相對豐度為36.24%）、Gibellulopsis（相對豐度為13.44%）以及鏈格孢屬（Alternaria，12.13%）。而線椒原料上的優勢菌為鏈格孢屬（Alternaria，相對豐度29.39%）、織球殼菌屬（Plectosphaerella，19.43%）、腥擲孢菌屬（Tilletiopsis，11.63%）。

在朝天椒的清洗二次（CQX2）樣品中，鏈格孢屬（Alternaria）的相對豐度高達96.05%，并且在線椒清洗二次（XQX2）的樣品中，該菌屬的相對豐度也增高至55.51%。鏈格孢屬（Alternaria）是植物上常見的腐生菌，易引果實細胞壁坍塌且色澤變暗，對辣椒保脆保鮮不利[21-22]。在朝天椒和線椒的半成品中，鏈格孢屬（Alternaria）的相對豐度仍然較高，分別為29.62%和24.20%。此外，還存在織球殼菌屬（Plectosphaerella）、赤霉菌屬（Gibberella）以及鐮刀菌屬（Fusarium）等植物致病菌或致腐真菌屬[23-25]。

2.3 可培養微生物的變化

從圖6 可以看出，在加工過程中細菌與霉菌數量級在102～106CFU/g 之間。在鹽漬朝天椒半成品中可培養細菌數量由原料的2.2×105降至1.2×104CFU/g，可培養真菌則由原料中8.3×103降至8.4×102CFU/g，但第一次清洗后樣品中的在由8.3×103升高至1.6×104CFU/g，第二次清洗后降至6.6×103CFU/g。而在線椒原料在兩次清洗后，可培養細菌數量由2.6×104升高至2.6×106CFU/g，并且真菌數量也由1.4×104上升至1.6×106CFU/g。在拌鹽后可培養細菌和真菌的數量才分別降低至1.4×103和2.3×103CFU/g。結合菌落計數和測序結果發現，現有機械的清洗效果較差，尤其是在紅線椒加工中，這可能是由于兩次清洗均使用自來水沖洗且進水和出水的速率不一致導致在清洗環節中辣椒表明微生物出現積累。其次，線椒果實較長且表面積更大，因此同樣的清洗工藝無法滿足不同品種原料的清潔要求，需要采取延長清洗工序時間或改善清洗過程中換水的頻率才有利于微生物降低。

圖6 加工辣椒樣品中可培養微生物的變化Fig.6 Changes of culturable microorganisms in samples of processed pepper

3 討論

本研究利用高通量測序探討山東、山西的朝天椒和線椒在鹽漬辣椒加工過程中微生物的變化規律，結果表明兩種辣椒產地原料上附著的細菌和真菌菌群差異顯著，經鹽漬加工后，兩種辣椒中細菌菌群仍存在顯著差異（P＜0.05），而真菌菌群差異性則隨著加工是進行逐步減小，且細菌和真菌的豐富度、均勻度均極顯著降低（P＜0.01）。根據計數結果，在鹽漬朝天椒半成品中可培養細菌數量由原料的2.2×105降至1.2×104CFU/g，可培養真菌則由原料中8.3×103降至8.4×102CFU/g；而鹽漬線椒樣品中可培養細菌和真菌的數量分別降至1.4×103和2.3×103CFU/g。預加工過程中兩種辣椒樣品中微生物數量呈現下降趨勢，產地預加工效果較好。

剁辣椒的最大特點就是脆辣酸爽，產地加工是保持辣椒原料脆度是重要前提，除品種差異外，微生物分泌果膠酶和內源酶對辣椒果實軟化也是影響脆度的重要因素，因而，在產地加工過程中，降低微生物數量是必要的，同時也降低了條件致病菌帶來的風險。本研究結果表明，相較于朝天椒樣品中菌群和計數結果的變化，線椒樣品在兩次清洗的效果較差，清洗后反而出現微生積累現象，需采取延長清洗工序時間或改善清洗過程中換水的頻率等方法來減少微生物數量。所以，現有的產地加工工藝是可行的，但應結合辣椒原料的特點進行差異化設計，并關注清洗階段的效果可能對后期加工的影響，進行下一步研究和探討。若產地預加工清洗處理可有效降低微生物污染，則可適當降低拌入的食鹽含量，對后期加工及環境保護具有重要的影響。從產地預加工環節控制辣椒的質量，充分研究辣椒加工過程的內在品質變化，可為穩定產品品質提供支撐。本文主要針對產地預加工環節中微生物多樣性及數量上進行研究，不同鹽度及產地預處理對產品品質的影響則需要進一步研究、驗證。