基于高通量測序技術對6 種黃酒酒曲中微生物多樣性的研究

谷曉東，劉怡琳，席曉麗，陳志周,3,，馬艷莉,,，劉 旭，王印壯，李素萍

（1.河北農業大學食品科技學院，河北保定 071000；2.南陽理工學院張仲景國醫國藥學院，河南南陽 473004；3.河北農業大學機電工程學院，河北保定 071001）

黃酒是我國一種傳統的發酵酒精飲品[1]，其歷史悠久，大概已有7000 多年[2]，是中國民族酒類之一，與啤酒、葡萄酒并稱為世界三大古酒[2-3]。因其營養豐富，且具有獨特的風味[4]，素有“酒中之祖、液體蛋糕”之美譽，深受消費者的喜愛[5]。我國黃酒產地頗多，分布廣泛[6]，通常傳統工藝是以富含淀粉的糯米、黍米、小米、玉米、高粱等谷物為原料[7]，以曲藥作為糖化發酵劑，經過浸米、蒸米、攤涼、落缸、拌曲、發酵、壓榨、澄清、過濾、殺菌等過程釀造而成[8]。紅谷是河南省南陽盆地的特色農作物，外殼呈紅色，脫殼后得到的小米也稱紅小米，其性溫，是藥食兩用食材，具有清熱止渴、滋陰補腎、健脾暖胃之功效[9]，且富含多種營養物質、比例協調[10]。紅谷黃酒是以紅谷為原料經過傳統工藝釀造而成。

與傳統釀造食品相同，黃酒的釀造過程也是開放式發酵，環境中的微生物會與主要釀造微生物一起參與發酵過程，從而影響黃酒風味物質的形成[11-12]。酒曲是釀造傳統黃酒的重要原料之一，常被譽為“酒之骨”[13]，酒的好壞與酒曲密不可分。酒曲中含有種類繁多的微生物，既有細菌，又有酵母、霉菌等真菌[14]。霉菌、酵母和細菌被認為能產生大量的酶，用于細胞新陳代謝和隨后的小分子生成，這些酶有助于最終產品中風味的形成[1]。微生物的多種代謝產物對酒的風味、口感、質量、功能都有著非常重要的作用。因此，對于酒曲微生物的多樣性分析在黃酒品質的穩定和提升等方面有著重要的現實意義[15]。

高通量測序技術可以準確大規模的分析微生物的組成，客觀全面的分析微生物的群落結構[16]。沈馨等[17]采用高通量測序技術對3 個孝感鳳窩酒曲的細菌多樣性分析發現，鳳窩酒曲中存在大量的核心細菌菌群。Cai 等[18]對8 個發酵劑樣品進行了高通量測序，鑒定出10 屬酵母和霉菌，11 屬細菌；真菌多樣性分析表明，發酵劑樣品中的真菌成分存在顯著差異，發酵劑微生物群主要以根霉屬為主，表明其在甜黃酒釀造過程中淀粉水解中的重要作用。朱小芳等[19]通過現代分子生物學技術，研究了傳統黃酒浸米漿水中的細菌群落結構，發現乳酸菌是浸米漿水中的優勢細菌，種類繁多且數量占據優勢。因此，高通量測序技術具有高通量、高分辨率、成本低、能夠雙向測序等優點，能夠準確快速的分析出樣品中復雜的微生物群落結構，是樣品中復雜微生物多樣性分析的最佳方法[20-21]。

黃酒生產用曲分為大曲（例如大米紅曲、小米紅曲、麥曲）、小曲（例如中藥曲、藥曲），也有人使用黃酒曲釀酒。本研究所選用的釀酒原料“紅谷”是一種新興的黃酒釀造原料，在其研究過程中多為原料特性及工藝研究，而哪種酒曲更適用于其發酵釀造高品質黃酒還未被研究。故本研究采用高通量測序技術對黃酒6 種不同酒曲微生物多樣性及群落結構進行分析，旨在為后續紅谷黃酒發酵最優酒曲的選擇及研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米紅曲（JQ1）福建省古田縣程久紅粬有限公司；小米紅曲（JQ2）河南南陽潤之酒業；麥曲（JQ3）隨州市大洪山綠色生態保健食品有限公司；中藥曲（JQ4）江蘇微康生物科技有限公司；黃酒曲（JQ5）安琪酵母股份有限公司；酒藥（JQ6）湖北楚寨發酵制品有限公司；紅谷 河南南陽當地超市；甲醛（38%）洛陽市化學試劑廠；氫氧化鈉 天津市風船化學試劑科技有限公司；葡萄糖、苯酚 天津市科密歐化學試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸 天津市光復精細化工研究所；酒石酸鉀鈉、無水亞硫酸鈉天津市光復科技發展有限公司；鹽酸 洛陽昊華化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純；Power-Soil?DNA Isolation Kit 試劑提取盒 深圳市安必勝科技有限公司；KOD FX Neo 聚合酶、KOD FX Neo緩沖液 東洋紡（上海）生物科技有限公司；脫氧核苷三磷酸（dNTP）上海源葉生物科技有限公司；ddH2O上海譜振生物科技有限公司；OMEGA DNA 純化柱 廣州飛揚生物工程有限公司。

5424R 型高速冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司；PAL-α型糖度計 日本愛拓公司；ME204E型電子分析天平 梅特勒-托利儀器（上海）有限公司；PHS-3C 型pH 計 上海儀電科學儀器股份有限公司；DYY-5 型瓊脂糖凝膠電泳儀 北京六一儀器廠；101 型電熱鼓風干燥箱 北京市永光明醫療儀器廠；725N 型紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；DZKW-4 型電熱恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司；ZNCL-BS 型磁力攪拌器 上海卓越儀器設備有限公司；NanoDrop 2000 超微量分光光度計 上海在途生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同酒曲紅谷黃酒發酵過程中理化指標的測定 選擇不同酒曲（大米紅曲、小米紅曲、麥曲、中藥曲、黃酒曲、酒藥）進行發酵實驗，料液比（紅谷:酒曲:水）控制在1:0.16:0.5（g/g/mL）將蒸熟晾涼后的紅谷、酒曲、水混合均勻，落料品溫控制在28～30 ℃；前發酵維持7 d，發酵溫度為28～32 ℃；后發酵時間為23 d，控制溫度25～26 ℃釀造紅谷黃酒并對成品中的基本理化指標進行測定，并進行感官品鑒。樣品分析前采用8000 r/min 離心10 min，取上清液測定。酒精度、pH、總酸、氨基態氮含量：按照GB/T 13662-2018《黃酒》測定；總糖、還原糖含量：采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定[22]；可溶性固形物：使用糖度儀直接測定；出糟率：參照油卉丹[23]的方法。

1.2.2 黃酒感官品評 如表1，感官品鑒參考黃酒國標要求，邀請11 名經過培訓的專業評價員在感官評定實驗室評定打分：第一步，小組成員觀察，品嘗和嗅探黃酒，以識別和記錄所有感官屬性。第二步，小組成員討論并確定屬性，然后根據提供的標準建立最終的描述符。黃酒的4 個描述詞包括色澤（透明，較透明和渾濁），香氣（濃郁和較濃郁），口感（爽口，較爽口和不爽口）和風格（協調，較協調和不協調）。在最后一步，要求小組成員通過量化每個感官描述符來表達自己的判斷。

1.2.3 DNA 的提取和PCR 擴增 采用PowerSoil?DNA Isolation Kit 試劑提取盒提取酒曲微生物宏基因組的總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取結果，用NanoDrop 2000 超微量分光光度計檢測DNA 提濃度和純度。以提取的DNA 為模板，根據引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對細菌16S rDNA 的V3 和V4 區擴增。根據引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對真菌ITS1區域的擴増。

DNA 模板50 ng，正向和反向引物各0.9 μL，KOD FX Neo 聚合酶0.6 μL，KOD FX Neo 緩沖液15 μL，脫氧核苷三磷酸（dNTP）6 μL，加入ddH2O 定容至30 μL。PCR 擴增程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.4 高通量測序 PCR 產物通過1.8%瓊脂糖凝膠回收，利用OMEGA DNA 純化柱進行純化，用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，文庫構建和測序由北京擎科生物科技有限公司Illumina Novaseq6000 PE250平臺來完成。以上DNA 的提取、PCR 擴增及高通量測序均由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.3 數據處理

測序得到的數據是雙端序列的，首先將成對的Reads 拼成一條序列，對拼接效果進行質量控制和過濾，然后根據引物序列和序列首末兩端的barcode 進行區分樣品并得到有效序列，經過校正序列方向后，即為優化數據。使用Usearch 軟件，對前述得到的優化序列按97%的相似度進行操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）劃分，構建稀疏曲線（Rarefaction curves），計算樣品中微生物均勻度和豐富度指數，并統計分析細菌和真菌群落信息。

2 結果與分析

2.1 不同酒曲紅谷黃酒發酵過程中理化性質分析

由表2 可知，小米紅曲釀造的樣品酒精度最高，達到13.78%vol，與其他組有顯著性差異（P＜0.05）。其他發酵組的樣品酒精度都大于11%vol，滿足《黃酒》標準酒精度≥8.0%vol 的要求。紅谷黃酒采用半固態法釀制，酒曲是決定能否正常發酵以及發酵產品質量好壞的決定性因素。在釀酒期間，紅谷黃酒的酒精度隨發酵進行而劇升，酵母等微生物快速繁殖，將前期產生的可發酵糖轉化成酒精[18]，物料下沉，7 d左右酒醪上層液體澄清，之后緩慢發酵，25～30 d 發酵完成。

各發酵酒樣中pH 在3.5～4.6 范圍內（表2），符合黃酒酸度要求。氨基態氮是以氨基酸形式存在的氮元素，它的含量高低影響了黃酒的感官等級和質量風格。根據GB/T 13662-2018《黃酒》標準，非稻米黃酒的氨基態氮含量≥0.16 g/L 即表示發酵達到要求。發酵醪液中乳酸桿菌等微生物分泌的酸性蛋白酶，能分解表皮蛋白，可溶于水的小分子氨基酸、呈味肽等活性成分被分泌出來[24]。在發酵組中，用小米紅曲釀造的黃酒中氨基酸態氮水平較高，使紅谷中的蛋白質資源得到了有效的利用，增加了酒體鮮味。

表2 不同酒曲釀制的紅谷黃酒理化指標Table 2 Physiochemical indexes of red millet Huangjiu brewed with different koji

在釀造期間，原料在各種水解酶的作用下，細胞內容物溶出，發酵醪中可溶性固形物也增加[25]。各發酵組間差異顯著（P＜0.05），由表2 可知，小米紅曲釀造的黃酒的可溶性固形物含量較高，為12.9Brix%。

由表2 可知，總糖和還原糖呈現相似特征，以黃酒曲和酒藥為發酵劑釀制的黃酒樣品顯示出較好的還原糖代謝能力。六種酒曲釀造黃酒樣品的出糟率高低依次為小米紅曲＜酒藥＜黃酒曲＜麥曲＜大米紅曲＜中藥曲，發酵組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。出糟率與原料的淀粉利用率是成反比的，所以造成這種情況的原因是小米紅曲中的微生物發酵時能分泌大量的糖化酶，落料后飯粒能很好糖化溶解，增加了淀粉的利用率，而中藥曲發酵時醪液呈糨糊狀，從而降低淀粉酶解速率。

2.2 不同酒曲黃酒的感官評價

黃酒的感官分析，即通過產品的外觀、香氣、口味、風格得到黃酒的整體印象，可以直觀反映黃酒香氣強弱及優劣程度。6 組黃酒感官評價結果如表3。在感官指標方面，黃酒外觀呈紅色（大米紅曲、小米紅曲），白色（酒藥），黃色（麥曲、中藥曲、黃酒曲），清透明亮，有晶瑩光澤，酒液底部顯示少量聚集物，有黃酒獨有的濃郁、爽口感。6 組黃酒按感官評分由高到低依次為小米紅曲，大米紅曲，黃酒曲，酒藥，麥曲，中藥曲。由此而言，這表明酒曲的種類對黃酒釀造有重要影響。

表3 不同酒曲釀制的紅谷黃酒感官品評價Table 3 Sensory evaluation of red millet Huangjiu brewed with different koji

2.3 紅谷黃酒酒曲中微生物多樣性分析

基于ITS1 和16S rRNA 測序，觀察到的OTU稀疏曲線、ACE 指數、豐富度（Chao 1）指數、香濃（Shannon）指數、相對豐度被用于評估6 種黃酒酒曲樣品中的真菌和細菌多樣性、豐度。測序數據和分析表明，ITS1 和16S rRNA 基因的文庫通常構建良好。

2.3.1 OTU 聚類及稀釋曲線分析 為了解并分析試驗樣本測序結果包含的菌屬等信息，對Reads 在97.0%的相似度水平下進行預聚類、并將其分類為OTUs，每個OTU 對應于一種代表序列，然后基于OTU 進行物種注釋，利用聚類程序Usearch 軟件，對這些序列進行聚類后，各樣品OTU 的個數不同，黃酒酒曲樣品中所含OTU 數量如表4。

由表4 可知，6 種黃酒酒曲中，細菌和真菌OTU總數分別為477 和214，細菌OTU 數目均大于真菌OTU 數目。JQ3、JQ4 中細菌、真菌OTU 數目最多，JQ1 中細菌、真菌OTU 數目最少。

表4 不同酒曲樣品細菌和真菌OTU 數目Table 4 Number of bacterial and fungal OTUs in different rice wine kojis samples

在相同的測序深度下，還可以比較不同樣本中OTU 的數目，在一定程度上評判樣本的多樣性高低。稀釋曲線如圖1 所示，對于細菌，當測序量小于10000 時，OTU 數目快速增加，在序列數目為10000～70000 之間時，除發酵劑JQ2 樣品外，隨著序列數的増加，OTU 數目增加走勢趨于平緩，表明測序趨于飽和，當前測序結果可以足夠反映樣本中微生物多樣性。對于真菌，當序列數目小于20000 時，樣本的OTU 快速增加；當序列數目大于20000 時，除發酵劑JQ3 和JQ1 樣品快速增加外，大部分樣本的OTU緩慢增加。雖然真菌稀釋曲線還未達到平臺期，但是每個樣品測序覆蓋率均超過99.95%；這表明即使測序深度和測序量的增加可能會繼續發現新的種屬，但是酒曲中的微生物多樣性卻不會隨測序的增大而改變，當前測序結果可以足夠反映樣本中微生物多樣性[26]。

圖1 細菌和真菌稀釋曲線Fig.1 Bacteria and fungi rarefaction curve

2.3.2 不同酒曲微生物的Alpha 多樣性分析 由表5可知，6 種酒曲樣品經測序后共獲得445483 條高質量細菌序列。在97%相似度情況下，細菌ACE 指數在332.99～411.07 之間，Shannon 指數在3.73～6.02之間，Chao 1 指數在349.05～460.14 之間，覆蓋率范圍99.91%～99.99%。JQ3、JQ4 的細菌Chao 1 指數和ACE 指數均處于較高的數值，這表明JQ3、JQ4的細菌群落豐富多較高，其群落結構較為復雜。如圖2a 所示，隨著測序量的增加物種的數量也在增加，但是Shannon 曲線卻進入平緩期，趨于穩定，這表明物種數量達到飽和，即使有新的細菌物種產生，但是細菌的多樣性也不會隨著測序量的增加而發生變化。

表5 不同酒曲細菌和真菌多樣性指數表Table 5 Diversity index of bacteria and fungi in different rice wine kojis samples

圖2 六種酒曲中細菌和真菌的Shannon 指數圖Fig.2 Shannon index of bacteriaand fungi in six rice wine kojis

6 種酒曲樣品經測序后共獲得476726 條高質量真菌序列。在97%相似度情況下，真菌ACE 指數在119.40～190.60 之間，Shannon 指數在0.64～3.02之間，Chao 1 指數在143.00～162.40 之間，覆蓋率范圍99.95%～99.97%。JQ1、JQ3 的真菌Chao1 指數和ACE 指數均處于較高的數值，這表明JQ1、JQ3的真菌群落豐富多較高，其群落結構較為復雜；如圖2b 所示，隨著測序量的增加物種的數量也在增加，但是Shannon 曲線卻進入平緩期，趨于穩定，這表明物種數量達到飽和，即使有新的真菌物種產生，但是真菌的多樣性也不會隨著測序量的增加而發生變化。

實驗樣品中細菌的Chao 1 指數和ACE 指數均遠大于真菌的指數，這表明6 種黃酒酒曲中細菌物種豐富度均遠高于真菌。實驗樣品中細菌和真菌的文庫覆蓋率都比較高，這表明本次測序結果基本能夠代表樣品的實際情況。

2.4 不同酒曲微生物的群落結構分析

2.4.1 細菌群落結構分析 在門水平上6 種酒曲共檢測出15 個細菌門，由圖3a 可知，其中豐度最高10 種分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、鹽厭氧菌門（Halanaerobiaeota）、軟壁菌門（Tenericutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）。如圖3a 所示，不僅相對豐度較高并且6 種酒曲中均有分布的為厚壁菌門、變形桿菌門、放線菌門。不同酒曲之間其微生物菌群也有顯著的不同，其中JQ2，JQ3，JQ4，JQ6 的第一優勢細菌門為厚壁菌門，豐度分別為32.65%，40.46%，68.46%，48.22%；變形桿菌門是JQ2，JQ3，JQ4，JQ6 的第二優勢細菌門，占樣品序列的28.52%，16.75%，14.01%，18.33%。而JQ1，JQ5的第一優勢細菌門為變形桿菌門，豐度分別為46.89%，51.88%；厚壁菌門是他們的第二優勢細菌門。放線菌門主要存在于JQ1，JQ2，JQ4 中，豐度分別為22.54%，22.64%，13.43%，在JQ6 中最少僅為2.22%。藍細菌門主要存在于JQ3，JQ5 中，占樣品序列的20.46%，14.90%。不同酒曲之間其微生物群落組成不同，其中JQ1，JQ2，JQ4 細菌微生物群落組成較為相似，JQ3，JQ5，JQ6 細菌微生物群落組成較為相似，但是他們的相對豐度存在著明顯的差異。

圖3 不同酒曲中主要細菌門和主要細菌屬的分布Fig.3 Changes in relative abundance of major bacterial phylum and major bacterial genus in different Koji

在屬水平上6 種酒曲中的細菌屬共檢測到247 種，如圖3b 所示，其中豐度最高10 種分別為腸桿菌科未培養細菌屬（uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、未培養葉綠體細菌屬（uncultured_bacterium_o_Chloroplast）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、不動細菌屬（Acinetobacter）。每種酒曲的細菌屬組成都存在著較大的差異，腸桿菌科未培養細菌屬（uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）是6 種酒曲共有的細菌屬，但其豐度有著很大的差異。JQ1 中主要細菌屬的組成為腸桿菌科未培養細菌屬（uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae，10.87%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus，20.86%）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella，30.46%）。乳酸桿菌屬（Lactobacillus）是JQ1樣品中的優勢菌屬。在JQ2 中，雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和腸桿菌科未培養細菌屬（uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae）為優勢細菌屬，含量分別為19.31%和16.77%。未培養葉綠體細菌屬（uncultured_bacterium_o_Chloroplast）是JQ3、JQ5 中的主要細菌屬，其豐度分別為20.44%、14.90%。枝芽孢菌屬（Virgibacillus）僅在JQ4 中作為優勢細菌屬，占樣品序列的27.04%。葡萄球菌屬（Staphylococcus）只在JQ6 中豐度最大，為30.45%，在其他酒曲中占比很少甚至可以忽略不計。

據報道，酒曲中的細菌屬有芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、芽孢梭菌屬、葡萄球菌屬、微細菌屬、醋桿菌屬等菌屬[27]。芽孢桿菌屬可以產生淀粉酶以及蛋白酶，在釀酒過程中有著及其重要作用，能夠降解淀粉、蛋白質等大分子物質[28]。李艷等[29]發現在羊羔大曲中乳酸桿菌屬是其優勢菌屬，其含量的高低影響著甜酒中酸味的輕重。劉蕓雅[30]等發現麥曲中優勢菌屬為芽孢桿菌屬。鄭亞倫等[31]研究發現兩種高溫大曲細菌群落的優勢菌屬為克羅彭斯特菌屬、糖多孢菌屬、高溫放線菌屬、芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬和魏斯氏菌屬。有相關文獻報道大曲的主要優勢微生物菌屬為芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、乳酸球菌屬[32-34]。上述優勢細菌屬與本研究的細菌屬有部分重合。

2.4.2 細菌微生物群落相似性分析 由主坐標分析圖4a 可知，JQ1，JQ2 的距離較近，群落差異較小；JQ4，JQ6 的距離較近，群落差異較小；JQ5 距離其他5 種酒曲的距離都較遠，差異較大為單獨的一個組群。通過對樣品細菌Beta 多樣性距離矩陣進行層級聚類分析，構建樣品層級聚類樹研究不同樣品的相似性和差異性[35]。如圖4b，6 種酒曲可分為3 類，JQ1，JQ2 的細菌屬聚為一類，JQ3，JQ4，JQ6 的細菌屬聚為一類，JQ5 的細菌屬單獨為一類，Beta 分析結果與PCoA 分析較為相似。

圖4 細菌相似性分析Fig.4 Bacterial similarity analysis

2.4.3 真菌群落結構分析 在門水平上，6 種酒曲共檢測出6 個真菌門，由圖5a 可知分別為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、隱菌門（Rozellomycota）。在門水平上相對豐度高并且6 種酒曲中都存在的真菌門為子囊菌門。不同酒曲樣品之間其微生物群落組成也存在著差別。JQ1、JQ2、JQ3、JQ4 中97.5%以上都為子囊菌門，其中JQ1 中的豐度更是高達99.9%。擔子菌門是JQ5 中的第二優勢真菌門，其豐度為36.47%。毛霉門為JQ6 中的第二優勢真菌門，占樣品序列的41.50%。

圖5 不同酒曲中主要真菌門和主要真菌屬的分布Fig.5 Changes in relative abundance of major fungi phylum and major fungi genus in different Koji

在屬水平上6 種酒曲中的真菌屬共檢測到93種，如圖5b 所示，其中豐度最高10 種分別紅曲霉屬（monascus）、曲霉菌屬（Aspergillus）、塞伯林德納氏酵母屬（Cyberlindnera）、耐干霉菌屬（Xeromyces）、米根霉屬（Rhizopus）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、節擔菌屬（Wallemia）、嗜熱菌屬（Thermomyces）、絲衣霉菌屬（Byssochlamys）、季也蒙邁耶氏酵母屬（Meyerozyma）；由圖5b 可看出，每種酒曲的真菌屬組成都存在著較大的差異。JQ1 中第一、第二優勢真菌屬分別為塞伯林德納氏酵母屬和紅曲霉屬，其豐度分別為71.45%及25.38%。JQ2 的優勢菌屬為紅曲霉屬，占樣品序列的92.03%。JQ3 的優勢菌屬是曲霉菌屬、熱子囊菌屬、嗜熱菌屬、絲衣霉菌屬，豐度分別為26.55%、24.09%、21.88%、18.45%。JQ4的優勢菌屬是耐干霉菌屬（19.67%），JQ5 的優勢菌屬是曲霉菌屬（54.11%），米根霉屬（41.50%）是JQ6的優勢菌屬。

子囊菌門為絕對優勢菌門，擔子菌門與毛霉門是僅次于子囊菌門的優勢菌門，這與凌夢螢的研究結果一致[36]。王丹丹等[37]發現孝感鳳窩酒曲在門水平上子囊菌門為其主要真菌門，這與本研究中子囊菌門是六種酒曲優勢真菌門結果一致。孝感米酒的相關研究發現其優勢真菌屬是根霉屬、曲霉屬、酵母屬[18]。曲霉屬等絲狀真菌可在黃酒發酵過程中分泌α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等有利于淀粉糖化、蛋白質分解的酶類[38]。據研究發現，紅曲霉屬可以代謝多種酶類并能促進底物分解[39]。鄭亞倫等研究發現兩種高溫大曲優勢真菌屬為熱子囊菌屬、嗜熱真菌屬和曲霉菌屬等[31]。

2.4.4 真菌微生物群落相似性分析 如圖6a 所示，真菌NMDS 結果與細菌存在著差異，JQ1、JQ2 距離較近，同在第四象限，二者群落差異較小。JQ3、JQ4、JQ5 三者距離較近，同在中下部，它們之間的群落差異較小。JQ6 在第一象限右上方，距離其他五個點都比較遠，存在著較大的差異，其單獨為一個組群；由圖6b 可知，6 種酒曲可分為3 類，JQ1，JQ2 的真菌屬聚為一類，JQ3，JQ4，JQ5 的細菌屬聚為一類，JQ6的細菌屬單獨為一類，Beta 分析結果與NMDS 分析結果一致。

圖6 真菌相似性分析Fig.6 Fungi similarity analysis

3 結論

利用高通量測序技術對6 種不同酒曲的微生物群落以及物種多樣性之間的差異進行分析，從6 種酒曲中共檢測出15 個細菌門和6 個真菌門；247 個細菌屬和93 個真菌屬。酒曲中含有豐富的微生物群落，不同酒曲盡管其有著相似的微生物群落結構，但是他們的豐度仍然有著明顯差異。6 種酒曲中，JQ1、JQ2 的細菌種群和真菌種群都相似，JQ3、JQ4、JQ6 的細菌種群較為相似，JQ3、JQ4、JQ5 的真菌種群比較相似，這體現了酒曲中微生物組成種類的復雜程度。微生物的多種代謝產物對酒的品質、口感都有著非常重要的作用，本研究通過對6 種不同酒曲的微生物群落結構進行研究，為后續黃酒發酵最優酒曲的選擇提供了理論參考。