干酪乳桿菌HDS-01 發酵對酸菜品質和細菌群落結構的影響

王 旭，曹春振，楊志馨，潘 月，宋 剛,

（1.農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱 150500；2.黑龍江大學生命科學學院，微生物省高校重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150080）

酸菜是我國東北地區傳統發酵的蔬菜制品，采用大白菜在低鹽濃度條件下，經過乳酸發酵制成[1]。酸菜以酸香味醇、清脆爽口、清淡解膩的品質贏得國內外廣大消費者的喜愛[2]。大白菜無需滅菌處理，發酵過程中的微生物種類極其復雜，所以無論是家居式還是工廠式腌制，在口感和風味上都呈現出“一家一款、家家不同”的局面。傳統酸菜發酵過程中，乳桿菌屬（Lactobacillus）雖然占據優勢地位，但變形桿菌屬（Proteus）、大腸桿菌（Escherichia coli）和沙門氏菌屬（Salmonella）等致病菌仍大量存在，食品安全存在風險[3]。

乳酸菌具有益生功能，用作發酵劑增強了碳水化合物降解和乳酸的生成[4]。王芮東等[5]通過高效液相色譜法，分析自然、老泡菜水和乳酸菌制劑三種方式發酵過程中有機酸含量的變化，結果表明，乳酸菌制劑發酵泡菜的有機酸總量始終高于其他兩種發酵方式。Yang 等[6]研究發現，接種乳酸菌可以更快速地降低發酵系統的pH，縮短發酵時間。然而，發酵食品的風味以及化學成分含量源自于微生物群落之間的代謝活動[7]。Xiao 等[8]研究了四川泡菜中微生物區系與風味的相關性，結果表明，細菌對風味形成的貢獻高于真菌，而乳酸菌、明串珠菌、無色桿菌和片球菌與風味密切相關。因此，有必要全面解析發酵過程中微生物群落結構和化學成分的動態變化，以便精確調控發酵工藝，從而形成風味獨特且富含營養價值的高質量酸菜產品[9-10]。

目前，廣泛應用在酸菜發酵生產的菌株主要包括腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）等[11-12]。不同乳酸菌具有不同的功能特性，廣泛應用在不同的工業領域，開發新型發酵劑應用在酸菜發酵中將會促進酸菜產業的進一步發展。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）具有高效降血壓、降膽固醇，增強人體免疫及預防癌癥等益生保健作用[13]，在功能性食品開發的領域受到了越來越多的關注，但有關L.casei作為蔬菜發酵劑的研究報道較少。本研究以分離自酸菜發酵液的一種高產乳酸的L.caseiHDS-01[14]作為發酵劑，構建酸菜發酵微生物生態體系，以自然發酵酸菜為對照，分析發酵過程中關鍵代謝產物的變化，分析乳酸代謝途徑關鍵酶活力、群體感應基因LuxS表達以及細菌多樣性的差異。研究結果對酸菜工業化的穩定性控制、發酵用菌種資源和功能菌的開發以及傳統酸菜工業菌種的選育具有重要的實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L.caseiHDS-01 分離自傳統酸菜發酵液，用于酸菜發酵，保藏于黑龍江大學微生物省高校重點實驗室；白菜、食鹽 哈爾濱家得樂超市；50 L 發酵桶哈爾濱道外生活器具批發市場；磷酸果糖激酶（PFK）活性檢測試劑盒、丙酮酸激酶（PK）活性檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測試劑盒、食品中亞硝酸鹽測定試劑盒 蘇州科銘生物技術有限公司。

FE20 pH 計 梅特勒-托利多（上海）有限公司；A560 紫外可見分光光度計 上海翱藝儀器有限公司；LC20A 高效液相色譜 日本島津公司；ABI7500熒光定量PCR 儀 美國Life Technologies 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生態體系構建 自然發酵：選取優質實心白菜，放置在陰涼處晾曬1～2 d 后去除壞葉，清洗干凈后整齊緊密放置于50 L 發酵罐中壓實，加入3%（w/v）的食鹽水浸泡，以1 kg 白菜加1 L 食鹽水的比例腌制，控制溫度在20～25 ℃之間，密封發酵，從第1 d起隔天取樣；人工發酵：挑取L.caseiHDS-01 單菌落，接入液體MRS 培養基[15]中，于37 ℃靜態培養18～24 h，離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌菌體并調整細胞濃度為108個/mL，即為種子液，按白菜質量的10%（w/v）接種量接入與自然發酵相同的發酵體系，控制罐體溫度在20～25 ℃之間，從第1 d 起隔天取樣。

1.2.2 pH 及乳酸菌數測定 pH：取發酵罐中多處位置的發酵液混合均勻，用pH 計連續測定三次，取平均值作為最終結果；乳酸菌總數：平板菌落計數法，參考GB 4789.35-2016 測定[16]。

1.2.3 乳酸和總酸含量測定 乳酸：參考張慧娟等[17]的方法測定；總酸：參考GB/T 12456-2008 測定[18]。

1.2.4 乳酸代謝途徑關鍵酶活力測定 取發酵液2 mL，10000 r/min，在4 ℃下離心10 min，棄上清，收集菌體。加入2 mL 提取液，超聲波破碎細菌（功率200 W，超聲3 s，間隔10 s，重復30 次），8000 ×g，于4 ℃離心10 min，取上清，置冰上待測。磷酸果糖激酶（Phosphofructo-kinase，PFK）、丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）和乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）活力測定方法參照試劑盒說明書進行。

1.2.5 亞硝酸鹽和VC含量測定 亞硝酸鹽含量：稱取0.20 g 酸菜樣品研磨成勻漿，采用食品中亞硝酸鹽測試盒測定酸菜中亞硝酸鹽的含量，具體實驗方法按照試劑盒說明書進行。

VC含量：采用紫外分光光光度法測定[19]，準確吸取VC標準溶液0.2、0.5、1.0、3.0、5.0 mL 定容至50 mL 的容量瓶中，以蒸餾水作空白試劑，在243.8 nm下測定吸光度值，以VC含量（μg）為橫坐標，以吸光度值為縱坐標作標準曲線，得回歸方程y=0.0708x-0.0024，R2=0.9998。準確稱取5.00 g 酸菜于研缽中，加入10 mL 體積分數為0.01 的鹽酸，快速搗成勻漿，10000 r/min，離心10 min，取2 mL 上清液于50 mL容量瓶中，加入1 mL 體積分數為0.1 鹽酸，用蒸餾水定容。取定容后的樣液2 mL，依次加入1 mL 體積分數為0.1 的鹽酸，0.3 mL Cu（NO3）2溶液，置于70 ℃恒溫水浴13 min 后，冷卻至室溫，以蒸餾水作空白，243.8 nm 下測定吸光度值。根據標準曲線，即可計算出樣品中VC的含量。

式中：C 表示標準曲線上查得還原型VC的含量（μg/g）；V2表示樣液定容后的體積（mL）；V1表示測定用樣液的體積（mL）；W 表示樣品重（g）。

1.2.6 酸菜感官評價 依據陳功[20]的方法并做相應調整，對發酵第21 d 酸菜樣品進行感官評價。邀請10 名感官評價員，從發酵液狀態、酸菜成品的顏色、氣味、味道和脆度這5 方面評價酸菜質量，見表1。

表1 酸菜感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of sauerkraut

1.2.7 16S rDNA 提取與檢測 按照QIAamp DNA Mini kit（Qiagen）說明書提取酸菜發酵液細菌DNA，選擇細菌16S rDNA V3～V4 區特異性引物338F（5'-barcode+ACTCCTACGGGAG GCAGCA-3'），806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。通過Tru-Seq Nano DNA LT Library Prep Kit（Illumina）進行建庫，利用MiSeq Reagent Kit V3（600cycles）進行2×300 bp 的雙端測序，測序獲得的下機數據通過fastqjoin 軟件拼接，對拼接后的tag 進行質控和過濾，得到有效數據[21]。

1.2.8 群體感應基因轉錄水平檢測 提取兩種酸菜發酵樣品不同時間點發酵液細菌的總RNA 進行純度和濃度測定。分別以luxS-down 為特異性下游引物合成cDNA 第一條鏈，每組取2 μL cDNA 作為模板，與各個基因的qRT-PCR 特異引物（表2）和熒光染料混合后，進行實時熒光定量PCR 擴增反應體系。獲得各樣品的CT 值以相對定量2-△△CT法進行分析，以內參基因16S rDNA 校正[22]。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.3 數據處理

所有試驗都重復3 次，運用SPSS Statistic 26 軟件對數據進行統計學分析，所有試驗數據均以平均值±標準偏差（standard deviation，SD）表示，P＜0.05代表均值間存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 pH 與乳酸菌數的變化

pH 對發酵食品的質量起著至關重要的作用，是決定發酵程度的關鍵變量。如圖1 所示，隨著發酵的進行，兩個發酵體系的pH 均先迅速下降后趨于平緩。人工發酵體系的pH 在發酵第3 d 就迅速下降至（3.15±0.08），而自然發酵體系的pH 則是在第7 d才下降至（3.56±0.07），且在整個發酵過程中，人工發酵酸菜的pH 始終低于自然發酵酸菜。到了發酵末期兩個體系的pH 分別為（3.46±0.07）和（3.79±0.10）。Yang 等[23]研究表明，添加乳酸菌發酵的酸菜的pH在第3 d 即可降至4 以下，而自然發酵酸菜則需要5 d，這與本研究結果類似。趙丹等[15]研究發現，添加乳酸菌發酵酸菜的pH 下降速率快于自然發酵，且當發酵液的pH 達到3.5～3.8 時食用酸菜，風味口感最佳，這與本研究結果一致。

圖1 酸菜發酵過程中pH 和乳酸菌數量的變化Fig.1 Changes in pH and lactic acid bacteria during fermentation of sauerkraut

乳酸菌數量的增加與pH 的降低直接相關，由于接種了發酵劑L.caseiHDS-01，人工發酵體系的初始乳酸菌數量（7.63±0.19）lg CFU/mL 高于自然發酵體系（2.50±0.15）lg CFU/mL。自然發酵體系中乳酸菌數量在發酵初始階段（1～7 d）呈指數上升，第7 d達到最高為（8.45±0.01）lg CFU/mL，到了發酵中期略有下降。原因是乳酸菌的大量繁殖抑制了部分不耐酸乳酸菌的生長，另一方面，微生物生長繁殖所需的碳源氮源等營養物質不足，使發酵液中乳酸菌數量逐漸減少。但無論接種與否，在發酵17 d 后，兩體系最終的乳酸菌數都達到了幾乎相似的值，但人工發酵過程中的乳酸菌數始終高于自然發酵，說明人工發酵比自然發酵更早進入酸性環境。此外，在使用其他乳酸菌發酵酸菜樣品中也得到類似結果[4,24]。酸性環境會抑制不耐酸致病菌繁殖，促進耐酸細菌生長，導致總酸含量增加，提高酸菜質量安全[25]。

2.2 乳酸含量和總酸含量變化

酸味是酸菜的主體風味，而總酸是表征酸菜酸味的理化指標。從如圖2A 可以看出，兩個發酵體系總酸含量均隨發酵進行呈上升趨勢，但整個發酵過程中人工發酵酸菜總酸含量始終高于自然發酵。到了發酵末期，兩體系總酸含量均達到最高值，分別為（8.45±0.38）和（6.56±0.30）g/L。各發酵系統中的乳酸含量變化趨勢與總酸一致，如圖2B，人工發酵酸菜的乳酸含量始終高于自然發酵，在發酵末期含量達到最高，分別為（7.88±0.38）和（4.95±0.25）g/L。發酵中期，當酸性環境形成后，絕大部分細菌都不耐酸，因此生長受到抑制。耐酸性較強的乳酸菌成為優勢菌群，開始生長繁殖，代謝產酸的同時，更穩固了其在發酵環境中的優勢地位。馬藝熒等[26]研究有機酸在東北酸菜發酵過程中的變化，結果表明，乳酸含量隨發酵的進行不斷增高，在發酵120 d 時達到（15.25±0.11）mg/g，與傳統發酵相比，篩選的乳酸菌直投發酵20 d 就達到相當的乳酸含量，大大縮短了發酵時間。

圖2 酸菜發酵過程中總酸（A）和乳酸（B）含量的變化Fig.2 Changes in acidity (A) and lactic acid (B) content during fermentation of sauerkraut

2.3 乳酸代謝途徑關鍵酶活力變化

酸菜腌制過程中的乳酸發酵主要借助于乳酸菌來實現，根據代謝產物的不同，可以將乳酸發酵分為同型乳酸發酵和異型乳酸發酵。異型乳酸發酵的產物有乳酸（約50%）、乙醇和CO2[27]。而同型乳酸發酵比異型乳酸發酵的乳酸菌耐酸性強，在糖酵途徑經PFK 和PK 等酶的作用下，將底物葡萄糖降解為丙酮酸，丙酮酸在LDH 的催化下還原為乳酸（可達80%），沒有乙醇和CO2生成，這一過程主要集中在酸菜發酵的中后期[28]。

本研究對同型乳酸發酵途徑中的關鍵酶PFK、PK 和LDH 進行監測。如圖3A 所示，兩個發酵系統中PFK 活力變化趨勢相同，均為先上升再下降最后趨于平緩，但變化速度卻不同。在人工發酵體系中，PFK 活力在發酵初期迅速上升，在第5 d 達到峰值（678.89±54.76）U/mg，而自然發酵體系中PFK 活力緩慢升高，直至第7 d 才達到峰值（275.43±34.43）U/mg。原因是接種了L.caseiHDS-01，人工發酵系統中乳酸菌數量遠高于自然發酵，乳酸菌繁殖代謝活躍，故而PFK 活力驟升。達到峰值后，活性均迅速降低，分別在第7 d（人工發酵）和第11 d（自然發酵）后保持穩定。原因是到了發酵中期，不耐酸的乳酸菌生長受到抑制導致PFK 活性下降；如圖3B 和圖3C 所示，兩個發酵體系中PK 和LDH 活力與PFK 大概一致，均在1～3 d 顯著（P＜0.05）上升，第3 d 達到峰值后呈下降趨勢，最終趨于平緩。結果表明，發酵初期（1～7 d）兩體系中的三個關鍵酶活力均顯著（P＜0.05）高于發酵中期和末期，且活性峰值總是為人工發酵＞自然發酵。因此，人工發酵酸菜的乳酸含量總是高于自然發酵酸菜，這一結果再次證明，人工發酵早期就有大量乳酸生成，進入實質性乳酸發酵階段要早于自然發酵。

圖3 酸菜發酵過程中果糖-6-磷酸激酶活力（A）、丙酮酸激酶活力（B）和乳酸脫氫酶活力（C）的變化Fig.3 Changes of PKF activity (A),PK activity (B) and LDH activity (C) during fermentation of sauerkraut

2.4 亞硝酸鹽含量和VC 含量變化

亞硝酸鹽被認為是食品安全評價的一個重要指標。如圖4 所示，在發酵前期，自然發酵酸菜中亞硝酸鹽含量迅速上升，在第7 d 達到峰值（31.88±1.60）mg/kg 后急劇下降，最終達到約（2.01±0.09）mg/kg 的穩定值。原因是酸菜發酵體系中存在大量含有硝酸鹽還原酶的雜菌，它們把白菜組織中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。隨著乳酸菌的生長繁殖，產生的亞硝酸鹽還原酶和形成的酸性環境（pH＜4.0）均能抑制了硝酸鹽還原菌的生長[21,29]。而人工發酵體系進入酸性環境要早于自然發酵體系，因此，整個發酵過程中亞硝酸鹽的含量也始終低于自然發酵，發酵末期為（1.55±0.86）mg/kg。結果表明，L.caseiHDS-01 能抑制亞硝酸鹽的產生，提高了酸菜在發酵期間的安全性。

圖4 酸菜發酵過程中亞硝酸鹽含量和VC 含量的變化Fig.4 Changes in nitrite and VC content during fermentation of sauerkraut

VC含量隨著發酵進行呈下降趨勢，且人工發酵中VC含量一直高于自然發酵，這與Du 等[11]研究結果一致。因為VC是一種己糖醛基酸，能穩定地保存于酸性環境[6]。人工發酵酸菜中L.caseiHDS-01 大量生長繁殖，代謝產酸，快速形成了酸性環境，減少VC的降解，到了發酵末期含量為（445.02±10.53）mg/kg。自然發酵初期，微生物種類繁多且乳酸菌不是優勢菌群，各類細菌大量生長繁殖，大量利用VC，使VC含量下降速率快，最終為（280.33±3.12）mg/kg。由此可見，L.caseiHDS-01 作為發酵劑能夠減緩VC的降解，提高了酸菜的營養價值。

2.5 酸菜感官評價

由表3 可知，自然發酵酸菜汁液渾濁、脆度低、沒有酸菜的香味，原因是發酵液酸度低，腐敗細菌的生長繁殖破壞了白菜組織中的蛋白質及含氮物質，導致發酵液渾濁。同時，黃慧福等[30]研究發現，自然發酵酸菜在發酵初期含有少量霉菌，霉菌中用來分泌分解果膠的酶導致蔬菜組織變軟、酸菜脆度降低。人工發酵酸菜湯汁清澈，具有酸菜的香氣，原因是人工接種的L.casei在發酵初期就產生大量乳酸，能夠抑制有害微生物的生長。此外，總酸含量的升高，果膠含量的增加，導致酸菜的脆性更好，因此賦予酸菜酸度適中、醇香爽脆的獨特風味[31]。從發酵液清澈度、酸菜的色澤、香氣、口味以及脆度等指標對比評價兩種酸菜樣品，人工發酵樣品整體感官評分為（8.65±0.15）分，高于自然發酵酸菜（5.43±0.35）分。因此，接入L.caseiHDS-01 作為發酵劑可顯著改善酸菜的感官品質，為酸菜帶來良好的口感，這一結果與趙丹等[15]的研究結果一致。

表3 酸菜樣品感官評分Table 3 Sensory evaluation scores of sauerkraut samples

2.6 細菌群落組成

在兩種酸菜發酵液樣本中共檢測到8 個菌門，分別為放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍藻細菌門（Cyanobacteria）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、髕骨細菌門（Patescibacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。如圖5A所示，在自然發酵微生物系統中優勢菌門為變形菌門（56.23%～99.05%），而人工發酵系統中優勢菌門始終為厚壁菌門（63.37%～95.80%）。

圖5 發酵過程中門水平（A）和屬水平（B）細菌群落組成分析和屬水平細菌群落PCA 分析（C）Fig.5 Analysis of flora structure at gate (A) and genus (B) level and principal component analysis of bacterial communities at the genus level (C) during fermentation of sauerkraut

兩種發酵體系屬水平細菌菌群結構如圖5B 所示，共檢測到99 種，主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、拉恩氏菌屬（Rahnella）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）和希瓦氏菌屬（Shewanella）。而在自然發酵系統中，初始階段乳桿菌屬的相對豐度僅為0.31%，在發酵第7 d 才上升至43.72%，到發酵第13 d 后基本趨于穩定，直至發酵末期時降至20.03%。Enterobacter和Pseudomonas分別為（2.85%～26.93%）和（10.72%～30.75%）。據研究發現，一些Enterobacter和Pseudomonas可用作生可導致食物腐敗，影響酸菜安全品質[32]。而在人工發酵系統中，發酵初始階段，Lactobacillus的相對豐度為95.79%，隨著發酵進行而輕微波動，到第19 d發酵末期時降至63.36%。整個發酵過程中，Enterobacter和Pseudomonas相對豐度分別為（0.04%～2.26%）和（0.28%～25.84%）和，含量遠低于自然發酵酸菜。

進一步采用PCA 分析比較了兩種發酵液樣本在屬水平上的相似性和差異程度。樣本物種組成越相似，反映在PCA 圖中的距離則越近。從圖5C 可知，隨著發酵進行，不同體系、不同時間點樣本細菌群落特征存在顯著差異（PC1 和PC2 的貢獻率分別為66.84%和19.49%）。對比兩個發酵體系，人工發酵系統中腐敗菌的相對豐度不斷減小且始終低于自然發酵。除了因為大量產生乳酸進入酸性，也可能是由于L.casei產生的抗菌物質抑制其他革蘭氏陰性菌的生長[33]。由此可以看出，乳酸菌數量的增加不僅可以降低微生物生態系統的物種多樣性，還能有效抑制腐敗菌的生長。

2.7 發酵體系激活群體感應評測

群體感應（Quorum Sensing，QS）是細胞之間的通信過程，這是一種可以共同調節細菌之間細菌行為和調節基因表達的機制[34-35]。張琦等[36]認為乳酸菌存在LuxS介導的種間QS 系統，調控細菌素和有機酸的生成，維持自身的優勢地位。本研究通過實時定量PCR 技術，監測群體感應基因LuxS表達水平的變化，以自然發酵每個時間點luxS的表達量為對照，檢測人工發酵各階段LuxS相對表達水平。如圖6所示，隨著發酵進行，人工發酵系統的luxS表達量與對照組相比始終顯著上調。在發酵7 和11 d 時最為顯著，分別上調了（5.71±0.33）和（6.72±0.41）倍，經t檢驗分析，差異極顯著（P＜0.01）。由此可以看出，人工發酵酸菜系統中存在群體感應調控機制，但群體感應現象如何通過LuxS表達量上升而促進整個酸菜發酵進程需要進一步研究。

圖6 L.casei HDS-01 酸菜發酵過程中luxS 相對表達水平Fig.6 Change in the relative expression level of luxS during L.casei HDS-01 fermentation of sauerkraut

3 結論

將高產乳酸的L.caseiHDS-01 接入酸菜發酵生態體系中，Lactobacillus迅速成為優勢菌屬，菌體密度增強，群體感應的信號因子達到閾值被激活，產生了大量乳酸，導致pH 迅速降低，優先進入酸性環境。酸性環境有利于VC的保留和亞硝酸鹽的降解，維持了Lactobacillus的優勢地位，抑制了腸桿菌屬等致病菌的繁殖。綜上所述，從感官品質上，接種L.caseiHDS-01 發酵的酸菜樣品湯汁清亮，色澤黃嫩，口味濃郁，口感清脆。從發酵工藝上，L.caseiHDS-01 發酵酸菜產品中VC含量和乳酸含量均比自然發酵酸菜更高，亞硝酸鹽含量和致病菌豐度更低，改善了酸菜的產品品質，提高了發酵產品質量和營養價值，提高了酸菜食用的安全性。