低共熔溶劑提取江南卷柏穗花杉雙黃酮的工藝優化

劉 超，黎維維, ，雷 杰，李 剛，盧德敏，徐大軍，盛小娜，伍明江,，王 剛,

（1.遵義醫科大學，貴州遵義 563000；2.遵義醫科大學醫學與科技學院，貴州遵義 563000；3.遵義醫藥高等專科學校，貴州遵義 563000）

江南卷柏為卷柏科卷柏屬江南卷柏植物（Selaginella moellendorffiiHieron.）的全草[1]，味辛、微甘，性平。別名為巖柏草、石柏，在我國資源豐富，長江以南貴州、重慶、云南和四川等地均有分布[2]。其具有利尿通淋、活血消腫、止痛退熱、清熱解毒等功效，可用于治療多種急慢性炎癥以及出血等病癥[3]。據報道江南卷柏中含有雙黃酮類、酚類、甾體皂苷、木質素類等成分[4]，該植物的主要有效成分是雙黃酮，其中含量最高的穗花杉雙黃酮（Amentoflavone，AME）具有較好的抗腫瘤、降血糖、抗炎、擴張血管和抗病毒等[5]作用。

雙黃酮類化合物傳統提取通常采用堿提酸沉法[6]、加熱回流提取法[7]、浸漬法[8]、滲漉法[9]，這些方法簡單、易操作，但耗時長、提取得率低，且長時間熱，對環境傷害極大，不利于環保。低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents,DESs），主要是由氫鍵受體氯化膽堿等與氫鍵供體有機酸和多元醇等組成的一種液體混合[10]。它可以作為一種對環境友好和可替代傳統提取劑的溶劑，其原料便宜，制備簡單，具有低蒸汽壓、易生物降解等優點[11]。

DESs 提取江南卷柏中穗花杉雙黃酮的研究目前未見文獻報道。故本實驗采用一步合成法制備了3 種低共熔溶劑，并結合超聲輔助提取江南卷柏中穗花杉雙黃酮，研究液固比、超聲時間、超聲功率等因素對AME 提取得率的影響，再利用響應面優化法對提取工藝進行再優化，以期對江南卷柏的開發利用提供相關參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

江南卷柏干藥材 采購自貴州（批號：20201016），并經遵義醫科大學生藥學教研室張玉金副教授鑒定為江南卷柏（Selaginella moellendorffiiHieron.）的全草；穗花杉雙黃酮標準品（純度≥98%）瑞芬恩生物公司；氯化膽堿、香葉醇、芳樟醇、α-松油醇 均為分析純，上海源葉生物科技有限公司；甲醇 分析純，科龍化工試劑廠；對苯甲磺酸 分析純，光復精細化工研究所；無水乙醇 分析純，川東化工公司；乙腈 分析純，上海試劑一廠；甲酸 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1260 型高效液相色譜儀、400MR DD2 型核磁共振儀 美國安捷倫公司；FA1004N 型電子天平菁海儀器公司；KQ118 型多頻超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；N-1100 型旋轉蒸發儀、OSB-2100 型水浴鍋 上海愛朗儀器有限公司；DLSB-2L/-20 型低溫冷卻液循環泵 上海豫康科教儀器設備有限公司；FW177 型粉碎機 泰斯特儀器公司；Nicolet IS5 型傅里葉紅外光譜 美國賽默飛世爾科技；Labsys evo 型熱重分析儀 法國塞塔拉姆公司；TU-1901 型紫外可見分光光度計 普析通用儀器公司；SHB-III 型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；DF-101S 型磁力攪拌器 鄭州科華儀器設備有限公司；722 型紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DES 溶劑的制備 選擇氯化膽堿（Choline chloride）[12]為氫鍵受體（hydrogen bond acceptor，HBA），芳樟醇（Linalool）、香葉醇（Geraniol）和α-松油醇（Alpha-Terpineol）為氫鍵供體（hydrogen bond donors，HBD）[13]，按照一定摩爾比混合，在氮氣保護下60 ℃攪拌至均勻的無色液體，制得不同DES 溶劑（表1）。

表1 不同類型的DES 溶劑Table 1 Different types of DES solvents

1.2.2 DES 溶劑的篩選 參考文獻[14]中的提取方法，稱取干燥粉碎的江南卷柏3 g，置于250 mL 錐形瓶中，加入DES 溶劑，液固比10 mL/g，提取時間30 min，超聲功率240 W，以AME 提取得率來考察不同的低共熔溶劑、摩爾比及含水量（見表2），篩選出最佳低共熔溶劑、摩爾比和含水量。

表2 DES 溶劑的篩選Table 2 Screening of DES solvents

1.2.3 DES 溶劑的結構分析 核磁共振分析（NMR）：將30 mg DES 加入核磁管中，然后加入500 μL 氘代DMSO（C2D6SO）溶解，充分混勻后，用核磁共振儀進行1H-NMR 和13C-NMR檢測。

傅里葉紅外光譜分析（FT-IR）[15]：DES 及各組分的傅里葉紅外光譜采用Shimadzu IR Affinity-1 進行檢測。掃描范圍為400～4000 cm-1，共掃描128 次。

熱重分析（TGA）：使用TA Q600 熱重分析儀，在氮氣下進行，檢測溫度范圍25～900 ℃，升溫速率10 ℃/min[16]。

1.2.4 單因素實驗 以最佳低共熔溶劑為提取劑，含水量20%，考察不同的提取條件（超聲功率：160、200、240、280、320 W；液固比：5、10、15、20、25 mL/g；超聲時間：10、30、50、70、90 min），HPLC 測定穗花杉雙黃酮的提取得率，考察不同條件對提取效果的影響。

1.2.5 響應面試驗 根據單因素實驗結果，選擇對AME 提取得率有顯著影響的工藝參數：即液固比、提取時間和超聲功率為單因素實驗的最佳條件，根據響應面Box-Behnken 設計出試驗方案，用Design-Expert 11.0 軟件進行3 因素3 水平5 個中心點，設計出17 組隨機的實驗。使用二次多項式模型來評估響應值與三個變量即A、B、C 之間的關系，如表3。

表3 響應面試驗因素水平設計Table 3 Response surface experimental factor level design

1.2.6 HPLC 色譜條件 色譜柱：Ascentis-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A），0.1%甲酸水溶液（B）；檢測波長：330 nm；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；供試品進樣量：20 μL。

1.2.7 AME 提取得率計算

式中：C 為江南卷柏中AME 的濃度，mg/mL；V 為江南卷柏提取液體積，10 mL；m 為江南卷柏藥材總質量，g。

1.2.8 不同提取方法比較 冷浸法（Cold maceration extract,CME）：根據秦晶晶等[17]研究的方法，取3 g江南卷柏藥材粉末，加入100 mL 95%乙醇，室溫浸漬6 h，過濾，濃縮，甲醇稀釋定容至10 mL，HPLC 分析，計算AME 得率。平行實驗3 次。

熱浸法（Hot maceration extract,HME）：根據韓秋菊等[18]的研究方法，取3 g 江南卷柏藥材粉末，加入100 mL 95%乙醇，50 ℃下浸漬6 h，過濾，濃縮，甲醇稀釋定容至10 mL，HPLC 分析，計算AME 得率。平行實驗3 次。

乙醇超聲提取法（Ethanol-UAE）：根據李洪玉等[19]的研究方法，取江南卷柏藥材3 g 粉末，加入100 mL 95%乙醇，超聲提取30 min，過濾，濃縮，甲醇稀釋定容至10 mL，HPLC 分析，計算AME 提取得率。平行實驗3 次。

離子液體超聲提取法（IL-UAE）：根據李國峰等[20]的研究方法，取江南卷柏藥材3 g 粉末，加入48 mL離子液體（[HMIM]·[PF6]）和12 mL 水，超聲提取30 min，過濾，濃縮，甲醇稀釋定容至10 mL，HPLC 分析，計算AME 得率。平行實驗3 次。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 DES 溶劑的篩選

2.1.1 不同DES 溶劑影響 本文考察了不同DES（Chcl-Lin、Chcl-Ger、Chcl-Alp）提取江南卷柏中AME的提取得率的差異。結果如圖1 所示，Chcl-Lin、Chcl-Ger、Chcl-Alp 對AME 的提取得率為Chcl-Ger＞Chcl-Lin＞Chcl-Alp，因此選擇Chcl-Ger 為最佳低共熔溶劑。

圖1 低共熔溶劑的篩選Fig.1 Screening of deep eutectic solvents

2.1.2 摩爾比的篩選 HBA 和HBD 的摩爾比是影響DES 理化性質的重要因素[21]。摩爾比差異會導致DES 粘度和表面張力差異[22]，進而影響目標分子的提取率。本文考察了Chcl-Ger 不同摩爾比（HBA:HBD=1:1、1:2、1:3、1:4、1:5）對AME 提取得率的影響。結果如圖2 所示，隨著摩爾比從1:1 增加到1:2，AME 提取得率隨之增大。這是由于HBD增加，使DES 粘度和表面張力降低，有利于的AME的傳質和溶出，導致AME 提取率提高；當摩爾比從1:2 進一步增加到1:5 時，AME 的提取得率反而降低，這可能是由于HBD 過多導致DES 與AME 間的相互作用減弱。因此選擇HBA:HBD=1:2 位最佳摩爾比。

圖2 氯化膽堿:香葉醇摩爾比的篩選Fig.2 Screening of choline chloride:geraniol molar ratio

2.1.3 含水量的篩選 不同的含水量會導致DES 的粘度差異，進而影響DES 對目標物質的提取得率[23]。本實驗考察了不同DES 含水量（10%、20%、30%、40%、50%）對AME 提取得率的影響。結果如圖3所示，當含水量從10%增加至20%時，AME 提取得率隨之增加；當含水量達到20%時，AME 提取得率最大；當含水量高于20%時，AME 提取得率反而降低，這可能是因為過大的含水量會導致DES 的粘度降低進而減弱DES 與AME 之間的相互作用。因此選擇20%為最佳含水量。

圖3 氯化膽堿:香葉醇含水量的篩選Fig.3 Screening of choline chloride:geraniol water content

2.2 Chcl-Ger 的結構分析

2.2.1 核磁共振分析 通過核磁共振分析對最佳的DES 進行了結構表征，Chcl-Ger 的13C-NMR 和1HNMR 如圖4 所示。從圖4A 可知，Chcl-Ger 中氯化膽堿碳原子的特征峰為67.3 和55.4 ppm，香葉醇碳原子的特征峰為17.97、57.91、124.42 和135.67 ppm；從圖4 B 可知，Chcl-Ger 共有4 個特征峰，分別為歸屬于氯化膽堿氫原子的3.11 ppm 和歸屬于香葉醇氫原子的1.75、4.38 和5.40 ppm。通過與香葉醇和氯化膽堿的標準圖譜對比可知Chcl-Ger 中碳原子和氫原子化學位移值與香葉醇和氯化膽堿的一致，說明合成Chcl-Ger 未發生化學反應，Chcl-Ger 為混合物。

圖4 氯化膽堿:香葉醇、香葉醇和氯化膽堿的核磁共振譜圖Fig.4 NMR spectra of choline chloride:geraniol,geraniol and choline chloride

2.2.2 傅里葉紅外光譜分析 Chcl-Ger、氯化膽堿和香葉醇的FT-IR 光譜圖如圖5 所示。由圖5 可知，香葉醇和氯化膽堿的νOH 峰（伸縮振動峰）在低共熔溶劑圖中發生微弱的變化，氯化膽堿的δC-H 特征峰（彎曲振動峰）從1477 cm-1藍移至低共熔溶劑1482 cm-1，香葉醇的δC-H 特征峰（彎曲振動峰）從1377 cm-1紅移至低共熔溶劑1373 cm-1，氯化膽堿的νC-N峰（伸縮振動峰）從1012 cm-1藍移至低共熔溶劑1026 cm-1。以上結果表明，Chcl-Ger 中具有強烈的氫鍵作用。

圖5 氯化膽堿、香葉醇及氯化膽堿:香葉醇的紅外光譜圖Fig.5 Choline chloride,geraniol and choline chloride:geraniol spectra of geraniol

2.2.3 熱重分析 Chcl-Ger 的熱重分析結果如圖6所示。由圖6 可知，Chcl-Ger 存在三個失重階段，第一階段為室溫到150 ℃，這部分的失重是由于DES中結晶水的釋放所造成的，第二階段為150 到300 ℃，在這一階段幾乎沒有重量損失，表明Chcl-Ger 在這段溫度范圍有良好的熱穩定性，溫度高于300 ℃后，DES 開始劇烈失重，這可能是由于各個有機基團分解造成的。

圖6 氯化膽堿:香葉醇的熱重分析圖Fig.6 Thermogravimetric analysis diagram of choline chloride:geraniol

2.3 單因素實驗

2.3.1 超聲功率的影響 由于超聲波產生的空化作用和熱效應會促使植物細胞的細胞細胞壁破裂，增加了目標物質的溶出。本文研究了不同功率（160、200、240、280、320 W）對AME 提取得率的影響。如圖7a 所示，在160～240 W 的超聲功率范圍內，隨著超聲功率的升高，AME 提取得率顯著增加，這可能是由于空化作用和熱效應導致；當功率達到240 W時AME 提取得率最大；當功率大于240 W 時，AME提取得率隨著功率的增加而減少，這可能是因為過大的功率產生了過多的雜質，而影響了AME 的溶出，因此選擇超聲功率240 W 用于之后研究。

2.3.2 液固比的影響 原料藥材與溶劑的比率會影響AME 的提取得率，適當的液固比會增加其接觸面積進而使得提取得率增加[24]。本文考察了液固比在5～25 mL/g 范圍內AME 的提取得率，結果見圖7b。當液固比低于10 mL/g 時，AME 提取得率隨著液固比的升高而增加；當液固比達到10 mL/g 時，AME提取得率最大；但當液固比大于10 mL/g 后，AME提取得率隨著液固比的升高而降低。其原因可能為過低的液固比會導致江南卷柏粉末與低共熔溶劑接觸不充分，使得AME 的提取不完全，當液固比過高時，DES 擴散到植物細胞內部的距離過長，溶解更多的雜質，導致AME 提取得率降低。因此，本實驗選擇 10 mL/g 液固比進行后續研究。

2.3.3 超聲時間的影響 提取時間會極大影響產物從植物中提取的效率，適當的提取時間才能盡可能使AME 被充分提取。本文考察了不同提取時間（10、30、50、70、90 min）對AME 提取得率的影響。由圖7c 可知，在30 min 內AME 提取得率隨提取時間的增加而增大；在提取時間為30 min 時，AME 提取得率最大；當提取時間高于30 min 后，AME 提取得率逐漸減小。這是由于過長的提取時間產生的機械效應或溫熱效應，導致了部分AME 的降解[25]，AME 提取得率降低。因此，本實驗選擇30 min 作為最佳提取時間。

圖7 單因素實驗Fig.7 Single factor experiments

2.4 響應面試驗

2.4.1 響應面優化AME 提取得率的結果 依據2.3 項下的單因素實驗結果和Box-Behnken，利用Design-Expert 11.0 軟件設計了3 因素3 水平5 中心總共17 組實驗，三因素即超聲功率（C）、液固比（A）、提取時間（B）。同時利用此軟件分析實驗結果，以AME（Y1）提取得率為響應值，Box-Behnken 分析結果如表4。

表4 Box-Behnken 試驗結果Table 4 Box-Behnken experimental results

將此表中數據用Design-Expert 11.0 軟件進行二次多元線性回歸方程擬合，分別得到江南卷柏提取物中AME 提取得率響應面模型的二次多元線性回歸方程分別為：Y1=2.8508+0.06525A+0.057625B+0.105625C-0.03125AB+0.04575AC+0.1345BC-0.7344A2-0.72115B2-0.61315C2。

2.4.2 Y1響應值的二次回歸模型的方差分析 為驗證二次回歸方程所構建的數學模型及模型中所有的參數是否具有統計學意義，對多元二次回歸模型Y1進行方差分析，由表5 可知，該二次回歸模型F值為464.09（P＜0.0001），說明該回歸模型顯著，方案具有可行性；決定系數R2=0.9983，校正決定系數R2Adj=0.9962，說明此模型方程能具有較好的反應響應值。失擬值P=0.2086，表明模型失擬值差異無統計學意義（P＞0.05），從而反映該模型可對江南卷柏提取物中的AME（Y1）提取得率進行準確的分析及預測。由表5 可知，模型的一次項A、B、C，交互項BC 和二次項A2、B2、C2對江南卷柏中AME 的提取得率影響顯著，影響實驗響應值綜合評分的F值分別為F（A）=19.84、F（B）=15.47、F（C）=51.99，各單因素對AME 得率得影響為：C＞A＞B，由此可知超聲功率對江南卷柏提取物中AME 的提取得率影響較大。

表5 Y1 方差分析Table 5 Y1 analysis of variance

2.4.3 響應面分析優化 根據Design-Expert 11.0軟件繪制的反映變量間交互關系的三維響應曲面（圖8）。從AME 的3D 模型可以表示兩個因變量如何影響測試結果，三維曲面圖的橫坐標表示任意兩個變量，縱坐標表示AME 的提取得率。圖中所示當超聲時間和液固比交互影響時，固定A 或B 的值，隨著另一個值的增大都能得到AME 得率呈現先上升后下降的趨勢，雖然液固比和超聲時間都能顯著影響AME 提取得率（P＜0.05），但二者交互作用對響應值的影響并不顯著（P＞0.05）。當超聲時間保持在零水平時，固定超聲功率或液固比任一值，AME 得率皆會隨其中單個因素的升高而先升高后降低，超聲功率和液固比都能對AME 得率產生顯著影響，但交互作用對響應值的影響無顯著性（P＞0.05）。當液固比為零水平時，超聲時間和超聲功率對AME 得率具有交互作用，固定B 或C 任一值，AME 得率隨另一因素的升高而先升高，再趨于減少，交互作用顯著（P＜0.001）。交互項對AME 得率的影響依次為：BC＞AC＞AB，且BC、AC、AB 之間的三維響應曲面均存在著最高點，說明響應值（Y1）具有最大值。

圖8 響應面分析因素間相互作用對AME 提取得率的影響的3D 曲線圖Fig.8 3D graph of response surface analysis factor inter-action interaction on AME extraction rate

2.4.4 驗證結果 對Y1的二次回歸方程求極值可以得到使得江南卷柏提取物中AME 提取得率可以達到最大值的提取條件：液固比10.23 mL/g，超聲時間為30.94 min，超聲功率為243.66 W，在此提取條件下AME 的提取得率可以達到理論最大值2.88 mg/g。提取條件實際調整為：液固比10 mL/g，超聲時間為31 min，超聲功率為240 W，在此條件下，AME 實際提取得率為（2.75±0.12）mg/g。

2.5 HPLC 色譜條件

在色譜條件下分別對江南卷柏提取物、AME 標準品、Chcl-Ger 低共熔溶劑進行檢測，結果如圖9所示。

圖9 HPLC 色譜圖Fig.9 HPLC chromatogram

2.6 不同提取方法比較

本文使用了4 種方法包括熱浸法（Hot maceration extract,HME）、冷浸法（Cold maceration extract,CME）、離子液體超聲提取法（IL-UAE）、乙醇超聲提取法（Ethanol-UAE），與低共熔溶劑超聲提取法（DES-UAE）比較其AME 提取得率的大小。如圖10所示，DES-UAE 與傳統的HME 和CME 相比，不僅能夠節約近11 倍（229 min）的時間，其提取得率也分別增加了近10 和5 倍；與IL-UAE 和Ethanol-UAE相比，雖然提取時間相同，但是DES-UAE 法AME的提取得率分別增加了近2 和4 倍。因此，低共熔溶劑法能快速、高效、環保地提取江南卷柏中的穗花杉雙黃酮，極大的拓寬了天然活性成分提取的途徑。

圖10 不同方法對江南卷柏中AME 提取得率的影響Fig.10 Influence of different methods on the content of AME in Selaginella moellendorffii

3 結論

本文依據DES 作為一種操作簡便、簡單易得、具有可設計性的特點，設計并合成了三種DES（Chcl-Lin，Chcl-Ger 和Chcl-Alp）用于提取江南卷柏中AME。篩選出摩爾比為1:2 和含水量為20%的Chcl-Ger 為最佳的DES。通過單因素實驗得出，最好的提取條件為液固比10 mL/g，超聲時間為31 min，超聲功率為240 W，在此條件下，AME 實際提取得率為（2.75±0.12）mg/g。與乙醇超聲提取法、冷浸法、熱浸法和離子液體超聲提取法這四種方法相比較，DES 法從江南卷柏中提取AME 的效果最好。以上結果表明DES 是一種快速高效、綠色環保的溶劑，極大拓寬江南卷柏的應用價值。本研究中篩選3 種二元DESs 考察AME 提取得率，今后可制備多種二元或者三元、多元的DESs 將其用于江南卷柏中更多活性成分的分離提取。