檸檬籽蛋白提取工藝優(yōu)化及其不同酶解肽抗氧化活性分析

叢之慧，李 迪，周法婷，劉夢雅，張幫奎，馬 莉，付 樂，張宇昊，顧 欣,,4,

（1.重慶三峽學院 生物與食品工程學院，重慶 404199；2.重慶匯達檸檬科技集團有限公司，重慶 402600；3.西南大學 食品科學學院，重慶 400715；4.三峽研究院（三峽庫區(qū)可持續(xù)發(fā)展研究中心），重慶 404199）

近年來，中國檸檬產(chǎn)量逐年遞增，廢棄檸檬籽的數(shù)量也大幅上升。檸檬籽的處理方法一般為丟棄或填埋，會對自然和社會環(huán)境造成破壞[1]。檸檬籽中含有多種具有生理功能的活性成分，如蛋白質(zhì)、黃酮類和檸檬苦素、果膠以及豐富的維生素[2]。檸檬籽蛋白作為植物蛋白有具有很高的研究價值。

現(xiàn)今關(guān)于植物籽蛋白酶解肽的研究眾多。徐世濤等[3]研究蘇麻餅粕多肽的氨基酸組成發(fā)現(xiàn)，它是一種優(yōu)質(zhì)高值的活性天然蛋白肽。楊玉蓉[4]研究了西藏野桃仁酶解多肽制備工藝以及抗氧化活性。吳峰等[5]則優(yōu)化了亞麻籽多肽的制備條件，并通過分析發(fā)現(xiàn)亞麻籽多肽具有一定的抗氧化活性。

抗氧化肽具有清除羥基自由基、終止單線態(tài)氧的生成、結(jié)合促氧化的過渡金屬離子以及與其它抗氧化物質(zhì)協(xié)同作用的功效，并且對防止機體生物膜的破壞，延緩衰老具有一定的功效。國外學者 Gholamali 等[6]對檸檬果實蛋白質(zhì)和多肽的研究表明其具有降血糖功效。已知柑橘種子中含有多種具有抗氧化功效的物質(zhì)。但目前研究植物源天然抗氧化肽主要集中在豆科和喬木科。檸檬籽蛋白肽在抗氧化方面則鮮有人探究。因此對檸檬籽蛋白肽及其抗氧化功能進行探究將會提高檸檬籽的利用率。

本研究以檸檬籽經(jīng)脫脂粉碎得到的檸檬籽粕為原料，對其檸檬籽蛋白提取工藝進行響應(yīng)面優(yōu)化，使用不同的蛋白酶酶解肽進行氨基酸組成分析、氨基酸評分、抗氧化能力研究及紅外光譜分析，為后續(xù)的檸檬籽多肽的研究以及檸檬籽多肽功能性食品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)；同時可以為植物蛋白原料的選擇提供實驗依據(jù)，為檸檬籽多肽以及其抗氧化的研究應(yīng)用供給一些實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

尤力克檸檬籽 重慶匯達檸檬科技集團有限公司；石油醚 淄博市臨淄東方紅化工廠；考馬斯亮藍G250 石家莊市拜昂生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶（1×105U/g）河南圣斯德實業(yè)有限公司；木瓜蛋白酶（5.0×105U/g）上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；復(fù)合蛋白酶（120 U/mg）、風味蛋白酶（5.0×104U/g）生化級別 上海源葉生物科技存限公司；二苯代苦味酰肼自由基 福建領(lǐng)江生物科技公司；三氯化鐵、鄰苯三酚、三氯乙酸、氫氧化鈉 國藥化學集團；無水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵 重慶川東化工集團有限公司；維生素C、過氧化氫 天津市化工試劑一廠。

DDQ-A01G1 型袖珍數(shù)顯筆式酸度計 河南雙洋環(huán)保科技有限公司；TLXJ-JIC 型飛鴿牌低速離心機 上海安亭科學儀器廠；L-8800 型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；SP-756 型紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；Alpha 1-2 LDplus型真空冷凍干燥機 德國Marin Christ 公司；FTIR-650 型傅里葉變換紅外光譜儀 天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 尤力克檸檬籽粕的制備 稱取一定質(zhì)量干燥的檸檬籽，經(jīng)粉碎過60 目篩后加入料液比1:5 的石油醚脫脂，在20 ℃的水浴振蕩器中提取3 h，經(jīng)抽濾固液分離，重復(fù)2 次，干燥固相，得到檸檬籽粕。再次研磨后得檸檬籽粕粉，用于蛋白質(zhì)提取。

1.2.2 檸檬籽可溶性蛋白的提取 采用趙功玲等[7]的方法稍作改動提取檸檬籽蛋白。將按1.2.1 方法取得的檸檬籽粕粉，按一定料液比調(diào)配檸檬籽粕粉水溶液，調(diào)節(jié)pH，進行恒溫攪拌后以5000 r/min 的速度離心10 min 后取上清液再次調(diào) pH 獲得沉淀，經(jīng)過水洗，離心，真空冷凍干燥后得到檸檬籽蛋白。

1.2.3 檸檬籽蛋白得率的測定 根據(jù)吳炳云等[8]方法稍作改動，用Bradford 法測定溶解蛋白含量。吸取0.60 mL 蛋白質(zhì)提取液于20 mL 離心管中，再加入1.40 mL 的蒸餾水和510 mL 的考馬斯亮藍溶液，振蕩混勻，靜置3 min。于波長595 nm 處測定蛋白質(zhì)提取液的吸光度值，以牛血清白蛋白為標準蛋白質(zhì)制作標準曲線，并建立回歸方程:y=5.905x+0.0619,R2=0.993。式中:y 為樣品中蛋白質(zhì)含量，x 為吸光度值。根據(jù)公式計算檸檬籽蛋白質(zhì)得率：

1.2.3.1 檸檬籽蛋白質(zhì)提取的單因素實驗 以pH=9.5，液料比20 mL/g，堿提時間60 min，堿提溫度50 ℃為基礎(chǔ)實驗條件。考察pH（8.5、9.5、10.5、11.5、12.5）、提取時間（30、60、90、120、150 min）、液料比（10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 mL/g）和提取溫度（40、45、50、55、60 ℃）對檸檬籽蛋白質(zhì)得率的影響。

1.2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化 根據(jù)單因素實驗的pH、時間、液料比，溫度的結(jié)果，利用Design Expert 11 軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，響應(yīng)面因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.4 尤力克檸檬籽蛋白氨基酸分析 參照 GB/T 5009.124-2016 等相關(guān)檢測方法進行檢測。使用L-8800 全自動氨基酸分析儀對試樣中的氨基酸進行分析。

1.2.5 營養(yǎng)價值評價 氨基酸評分采用氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）法[9]。按式（2）計算RAA；氨基酸比值系數(shù)（ratio coefficient of amino acid，RC）可以反映食物中氨基酸含量與模式氨基酸的偏離程度，RC 按式（3）計算。

式中：RC 為被測食物蛋白質(zhì)的第i 種EAA 的比值系數(shù)（1≤i≤7）；RAAi 為被測食物蛋白質(zhì)中的第i 種EAA 評分值（1≤i≤7）；RAA 為被測食物蛋白質(zhì)中的第i 種EAA 評分值的均值。

1.2.6 不同酶酶解檸檬籽蛋白 取蒸餾水，將蛋白粉末溶解制成一定濃度的蛋白溶液，分別在各酶的最適條件下進行酶解。將蛋白溶液置于恒溫水浴鍋中保溫放置，用1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至酶最適pH 后，分別加入不同種類的蛋白酶，酶解過程中每間隔20 min 用1 mol/L 的NaOH 溶液維持反應(yīng)體系的pH，具體條件見表2。酶解時間為結(jié)束后沸水滅酶10 min，冷卻至室溫，8000 r/min 離心10 min，取上清液冷凍干燥，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 不同蛋白酶酶解檸檬籽蛋白條件Table 2 Conditions for enzymatic hydrolysis of lemon seed protein by different proteases

1.2.7 不同檸檬籽蛋白酶解肽的抗氧化能力的研究

1.2.7.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）清除能力的測定 采用Jamdar 等[13]的方法，配制不同濃度梯度的樣品溶液為取2 mL 樣品溶液，和2 mL DPPH·無水乙醇溶液混合均勻，25 ℃下避光反應(yīng)30 min；在517 nm 處測定樣品反應(yīng)液吸光度，以維生素C 做對照。計算DPPH·清除率公式如下所示:

式中，Ai：樣品吸光度；A0：蒸餾水代替樣品的吸光度；Ai0：無水乙代替DPPH·無水乙醇溶液的吸光度。

1.2.7.2 羥基自由基（·OH）清除能力的測定 采用繆福俊等[14]的方法，在1 mL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液中加入過氧化氫2 mL、FeSO4溶液1 mL、水楊酸乙醇溶液1 mL，均勻混合；37 ℃下恒溫反應(yīng)30 min，510 nm 處測其吸光度，以維生素C 作對照，采用公式（5）計算·OH清除率。

式中:A1：樣品的吸光度值；A2：蒸餾水替換H2O2的吸光度值；A0：乙醇替換樣品的吸光度值。

式中：A0：蒸餾水代替樣品溶液；As：樣品組吸光度。

1.2.8 紅外光譜分析 將木瓜蛋白酶酶解肽、胰蛋白酶酶解多肽、復(fù)合蛋白酶酶解肽、風味蛋白酶酶解肽放置于冷凍干燥機種干燥24 h 至恒重，備用。將上述少許樣品和KBr 以1:200 比例碾磨成粉，使用壓片機將混合物制作成透明薄均勻薄片，以KBr 為參照樣，在室溫干燥環(huán)境中使用傅里葉變換紅外光譜儀進行紅外圖譜掃描，掃描范圍為400～4000 cm-1[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)三次，利用Design Expert 11 軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計,采用方差分析進行顯著性檢驗，繪圖采用Origin 2018 軟件，采用 SPSS 23.0 軟件根據(jù)Probit 回歸模型進行分析IC50計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 尤力克檸檬籽粕可溶性蛋白的提取

2.1.1 檸檬籽蛋白質(zhì)提取的單因素實驗結(jié)果及分析如圖1 所示，在基礎(chǔ)實驗條件下，當pH 在8.5～10.5 范圍內(nèi)時，蛋白質(zhì)得率隨著pH 的升高而顯著提高（P＜0.05）。這可能是由于在一定堿性范圍內(nèi)，pH 越高，溶液中蛋白質(zhì)分子間的氫鍵越容易被打破，隨著氫鍵被打破，蛋白質(zhì)分子間的相互作用力減小，會加強蛋白質(zhì)分子與水分子的結(jié)合，增加其與水的溶解度[17]。當pH 大于10.5 時，蛋白質(zhì)得率隨著pH 的升高而顯著下降（P＜0.05）；這可能是因為強堿導致溶液含鹽量增加，不易使蛋白質(zhì)溶出，且pH 過高容易使蛋白質(zhì)變性。為蛋白的進一步利用帶來限制。因此選擇pH 為10.5 左右可以獲得更高的蛋白質(zhì)得率。

圖1 單因素實驗結(jié)果Fig.1 Results of single factor experiment

在基礎(chǔ)實驗條件下，當堿提時間小于60 min 時，得率隨著堿提時間的延長而顯著提高（P＜0.05）。隨著時間的延長，對檸檬籽細胞壁的破壞作用更加完全，檸檬籽蛋白可以充分溶出。但當堿提時間處于90～150 min 時，蛋白質(zhì)得率隨著堿提時間的延長而顯著降低（P＜0.05）。這可能是由于當?shù)鞍踪|(zhì)長時間處于堿溶液時部分蛋白質(zhì)會出現(xiàn)聚集現(xiàn)象而產(chǎn)生沉淀，而與雜質(zhì)一起被離心分離，影響蛋白提取。綜上，選擇60 min 為最佳堿提時間。

在基礎(chǔ)實驗條件下，在液料比10:1～50:1 mL/g之間檸檬籽蛋白質(zhì)得率逐漸升高，至液料比40:1 mL/g時達到最大值10.73%，在此之后，得率隨著液料比的增加而顯著降低（P＜0.05）。其原因在于，當液料比較低時，溶劑量較少，溶液中的蛋白質(zhì)溶解度逐漸增大直至飽和，而隨著料液比繼續(xù)增加時，蛋白質(zhì)得率略微下降，但下降趨勢較為平緩，此時蛋白質(zhì)得率已達到最大，所以蛋白質(zhì)得率變化不大，因此選擇液料比為40 mL/g 更合適。

在基礎(chǔ)實驗條件下，當溫度小于45 ℃時，蛋白質(zhì)得率隨著溫度的升高而提高（P＜0.05）。在反應(yīng)初期，溫度升高，反應(yīng)速度加快，溶液中的分子的擴散速率增加，導致氮溶解指數(shù)升高，蛋白質(zhì)的溶出量增加，蛋白質(zhì)得率達到最大值[18]。溫度高于45 ℃，得率逐步下降，其原因在于隨著溫度升高，蛋白質(zhì)出現(xiàn)變性。因此，確定酶解溫度為45 ℃。

2.1.2 響應(yīng)面分析法對檸檬籽蛋白提取工藝的優(yōu)化

2.1.2.1 響應(yīng)面模型的建立及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken 中心組合實驗設(shè)計的原則，設(shè)計響應(yīng)面分析試驗的因素和水平的數(shù)值，見表3。響應(yīng)面分析結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面分析的試驗結(jié)果Table 3 Test results of response surface analysis

利用Design-expert.8.0.6 軟件程序進行回歸擬合，得出檸檬籽蛋白質(zhì)的得率對pH、堿提時間、液料比、堿提溫度的四元二次回歸方程如下:

Y（得率）=11.16+0.71A-0.20B+1.52C+0.27D-0.020AB-0.31AC+0.063AD+0.10BC+0.015BD+0.14CD-0.22A2+0.20B2-2.51C2-0.050D2

從表4 可以得出，模型項在P＜0.01 時有顯著差異，相關(guān)系數(shù)較高，失擬項不顯著，并且該模型R2=0.9790，R2Adj=90.46%，表明模型的擬合程度有效，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，實驗誤差小，能夠較好地描述試驗結(jié)果，由圖2 可得各項對檸檬籽蛋白質(zhì)提取的曲面效應(yīng)顯著，說明模型有較復(fù)雜的線性關(guān)系。由方程系數(shù)的絕對值可知檸檬籽蛋白質(zhì)得率影響因素依次為：D（溫度）＞B（時間）＞C（液料比）＞A（pH）。

表4 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic response surface regression model

圖2 是通過二次回歸模型擬合的各因素之間交互作用的響應(yīng)面分析圖。當響應(yīng)面圖的曲面越陡峭，兩兩因素的交互作用就越明顯，相反，當響應(yīng)面圖的曲面越平緩，兩兩因素的交互作用就越不顯著。由圖2 可知，各圖均開口向下，凸形曲面，都存在極值。交互項 AB、AC、BC 對響應(yīng)值影響不顯著（P＞0.05），AD、CD 對響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.05），BD 對響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01）。

圖2 各因素交互作用對檸檬籽蛋白得率的影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plot and of the effects of interaction of various factors on the extraction rate of lemond seed protein

2.1.3 檸檬籽蛋白質(zhì)最佳提取工藝的確定 通過Design-Expert 軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗優(yōu)化檸檬籽蛋白的提取工藝，結(jié)果顯示最佳提取工藝為：pH 10.410，時間60.950 min，液料比41.630:1 mL/g，溫度41.850 ℃。檸檬籽蛋白質(zhì)得率的預(yù)測值為13.06%，為了實際操作可行，最佳工藝條件修正為pH10.5，時間60 min，液料比41:1 mL/g，溫度40 ℃，在修正工藝條件下進行驗證的得率為12.25%± 0.01%，預(yù)測值與實際值誤差為0.81%，相差較小，表明該模型具有一定的可行性。

2.2 檸檬籽蛋白的氨基酸分析

對上述方法制得檸檬籽蛋白進行氨基酸分析，可知其共含有17 種氨基酸，其中包括7 種必需氨基酸（表5）。必需氨基酸（Essential amino acid，EAA）含量占比總氨基酸（Total amino acid，TAA）含量為31.8%，必需氨基酸占非必需氨基酸（Non-essential amino acid，NEAA）的46.7%。檸檬籽蛋白所含氨基酸量最高的兩種是谷氨酸和精氨酸，分別占據(jù)氨基酸總量的21.4%和10.6%。目前已有研究表明精氨酸具有較強的清除DPPH 自由基、ABTS+自由基、超氧自由基能力以及一定的還原力[19]，谷氨酸可以通過提高蘋果抗氧化酶系統(tǒng)和誘導抗氧化劑的積累來抑制活性氧的大量生成和細胞死亡[20]，可見這兩種氨基酸在食品的抗氧化性中發(fā)揮效用[21]。說明檸檬籽在抗氧方面具有潛力，可進一步進行抗氧化研究。

表5 檸檬籽蛋白氨基酸組成Table 5 amino acid composition of lemon seed protein

桑葉蛋白[22]與松茸蛋白[23]同屬于植物蛋白，氨基酸組成與檸檬籽蛋白較為相似，檸檬籽蛋白與桑葉蛋白對比，其必需氨基酸含量較高；其芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）的含量為6.7 g/100 g，可以顯著提高檸檬籽蛋白的抗氧化能力[24]。相較于松茸蛋白，檸檬籽蛋白疏水性氨基酸亮氨酸含量較高，為15.8 g/100 g，疏水性氨基酸被認為是影響自由基清除能力的關(guān)鍵因素之一[25]。

營養(yǎng)學上通常認為，所含的EAA 組成比例越接近人體需要，則品質(zhì)越優(yōu)。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United，F(xiàn)AO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）提出了評價蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的EAA 模式（FAO/WHO模式）。由表6 可知，在檸檬籽蛋白中除亮氨酸與賴氨酸，其他必需氨基酸呈現(xiàn)過剩的狀態(tài)（RC＞1）；第一限制性氨基酸為亮氨酸（RC=0.49）。含有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸的肽具有較強的自由基淬滅能力[26]。

表6 必需氨基酸組成比較及氨基酸評價Table 6 Comparison of amino acid composition and essential amino acid evaluation

綜上，檸檬籽蛋白中必需氨基酸種類齊全。與桑葉蛋白、松茸蛋白相比較，檸檬籽蛋白在總體評分上高于桑葉蛋白，與松茸蛋白基本持平，可進一步進行抗氧化性的研究。

2.3 檸檬籽蛋白酶解物抗氧化能力比較

四種蛋白酶酶解肽的DPPH·清除能力、羥自由基（·OH）清除能力、超氧陰離子（）清除能力數(shù)值，做出清除率趨勢圖。使用SPSS 23.0 軟件計算出IC50值，進行繪圖，結(jié)果如下。

從圖3 可得，四種酶解肽清除率都是隨著濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢，木瓜蛋白酶酶解多肽在濃度為1～2 mg/mL 之間DPPH·的清除率增長幅度最大，之后趨于平緩。而胰蛋白酶酶解多肽在1～2 mg/mL之間DPPH·的清除率增長幅度較大，而后趨于平緩，濃度超過5 mg/mL 后，呈現(xiàn)繼續(xù)增長的趨勢，從清除率來看，復(fù)合蛋白酶酶解肽和風味蛋白酶酶解多肽對于DPPH·的清除率都比較強。結(jié)合表7 分析，風味蛋白酶酶解肽對DPPH·的清除能力略高于復(fù)合蛋白酶酶解肽。清除DPPH·能力的大小依次為：風味蛋白酶酶解肽（IC50值為1.02 mg/mL）＞復(fù)合蛋白酶酶解肽（IC50值為1.52 mg/mL）＞胰蛋白酶酶解肽（IC50值為1.52 mg/mL）＞木瓜蛋白酶酶解肽（IC50值為3.54 mg/mL）。根據(jù)顯著性分析，四種酶解肽與維生素C 的DPPH·的清除能力IC50值存在極顯著差異（P＜0.01）。

圖3 酶解肽的DPPH·清除率Fig.3 DPPH·clearance rate of enzymatic hydrolysate peptide

在·OH清 除能力方面，如圖4 所示。四種酶解肽的羥自由基清除率都隨濃度增加而增加，具有較好的構(gòu)效關(guān)系，其中木瓜蛋白酶酶解多肽在5 mg/mL 后增長速率明顯加快。從清除率的趨勢圖來看，風味蛋白酶酶解肽在羥自由基清除表現(xiàn)最好。結(jié)合表7 可以看出，四種酶解肽對·OH清除能力的大小依次為：風味蛋白酶酶解肽（IC50值為5.02 mg/mL）＞復(fù)合蛋白酶酶解肽（IC50值為8.29 mg/mL）＞木瓜蛋白酶酶解肽（IC50值為8.92 mg/mL）＞胰蛋白酶酶解肽（IC50值為8.77 mg/mL）。木瓜蛋白酶酶解肽和胰蛋白酶酶解肽的·OH 清除能力IC50值無顯著差異（P＞0.05），木瓜蛋白酶酶解肽與風味蛋白酶酶解肽的·OH 清除能力IC50值存在顯著差異（P＜0.05），四種酶解肽與維生素C 的·OH 清除能力IC50（0.86 mg/mL）值存在顯著差異（P＜0.05）。

圖4 酶解肽·OH清除率Fig.4 ·OH clearance rate of enzymatic hydrolysate peptide

表7 各酶解肽抗氧化能力的比較Table 7 Comparison of antioxidant capacities of enzyme-hydrolyzed peptides

圖5 酶解肽·清除率Fig.5 clearance rate of enzymatic hydrolysate peptide

通過對比研究發(fā)現(xiàn)，海參多肽[27]清除DPPH·的IC50值（8.39 mg/mL）是胰蛋白酶酶解肽的DPPH·清除能力的IC50值的1.35 倍。魔芋飛粉多肽[28]清除·OH 能力的IC50值（14.16.mg/mL）是木瓜蛋白酶酶解肽的·OH 清除能力的IC50值的2.22 倍。楊梅蛋白酶解總肽[29]清除的IC50值（5.745 mg/mL）是胰蛋白酶酶解肽的清除能力的IC50值的4.33 倍。由此可見，檸檬籽蛋白酶解肽表現(xiàn)出較優(yōu)的抗氧化能力。

2.4 紅外光譜的測定

由圖6 可以得出，風味蛋白酶酶解肽相較其他三組樣品在2937 cm-1處出現(xiàn)了一處酰胺B 帶吸收峰，并且波長較短，其吸收峰波動較其他三組樣品波動幅度較大。在3440 cm-1附近的寬峰屬于酰胺A 帶，是由N-H 的伸縮振動導致的特征峰。酰胺I 帶（1656 cm-1）主要是由C=O伸縮振動引起的，N-H彎曲振動和C-N 伸縮振動引起酰胺帶。1415 cm-1為氨基酸殘疾側(cè)鏈基團-COO-伸縮振動引起的吸收峰，1076 cm-1附近的吸收峰由C-O的伸縮振動導致，400～800 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰由N-H和C-H伸縮振動導致。1245 cm-1處的吸收峰被認為是由C-O-C 的特征吸收峰，在1076 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰說明樣品分子中含吡喃環(huán)。四種酶解肽在1415 cm-1處吸收峰出現(xiàn)差異，可能由于木瓜蛋白酶解肽和風味蛋白酶酶解肽存在氨基酸殘疾側(cè)鏈基團-COO-，氨基酸殘基側(cè)鏈基團對抗氧化性有影響。相比較于胰蛋白酶酶解肽，存在-COO-的木瓜蛋白酶的抗氧化能力更強，木瓜蛋白酶解肽與風味蛋白酶酶解肽中可能存在醛基，在1656 cm-1附近是由于C=O伸縮振動和N-H 變角振動引起的非對稱伸縮振動峰，這表明樣品具有芳香性。醛基對抗氧化起到支持積極作用，使得木瓜蛋白酶酶解肽在抗氧化方面的清除·OH的能力上表現(xiàn)更強。在1076 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰，說明樣品分子中含吡喃環(huán)，表明物質(zhì)不易發(fā)生氧化反應(yīng)[30]。

圖6 酶解多肽的紅外光譜Fig.6 Infrared spectrum of enzyme-hydrolyzed polypeptides

3 結(jié)論

本文開展了以檸檬籽粕粉為原料，對檸檬籽蛋白進行提取，通過單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗得出檸檬籽蛋白質(zhì)得率的影響因素：D（溫度）＞B（時間）＞C（液料比）＞A（pH）。由Design-expert.8.0.6 軟件程序進行回歸擬合，檸檬籽蛋白質(zhì)的最佳提取條件為：pH10.5，時間60 min，液料比41:1 mL/g，提取溫度40 ℃，此時檸檬籽蛋白實際得率為12.25%±0.01%。對提取出的檸檬籽蛋白進行氨基酸組成分析，結(jié)果顯示：檸檬籽蛋白含有檢測的17 種氨基酸，種類完備，包括7 種必需氨基酸，含量為總氨基酸含量的31.8%。四種酶解肽均表現(xiàn)出體外抗氧能力，對DPPH·，· OH，清除率的IC50值均在10 mg/mL 以下，其中風味蛋白酶酶解肽與復(fù)合蛋白酶酶解肽能力較優(yōu)，但其抗氧化能力均弱于維生素C。結(jié)合紅外光譜分析檸檬籽蛋白酶解肽具有抗氧化活性官團特征吸收峰。本研究表明檸檬籽蛋白氨基酸種類齊全，檸檬籽蛋白酶解肽抗氧化能力較優(yōu)，可為檸檬籽食用價值提供參考依據(jù)，為今后進一步開發(fā)利用檸檬籽提供了數(shù)據(jù)支持。雖然本研究中檸檬籽肽在體外表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，但是其在體內(nèi)是否還能保持相同抗氧化活性以及其發(fā)揮抗氧化作用的機制以及還需要進一步研究。