板栗殼多酚的超聲波輔助低共熔溶劑提取工藝優化及其成分分析

張曉云，梅曉宏,

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.農業農村部農業轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083）

據聯合國糧食及農業組織（FAO）報道，2017 年中國的板栗產量占世界的83%以上，是世界上最大的板栗生產國[1]。板栗加工過程中產生大量的廢棄物，包括內殼和外殼，約占整個板栗重量的15%～20%[2-3]。這些板栗殼廢棄物通常用作燃料燃燒或者自然腐爛，不僅浪費資源還污染環境[4]。近年來有研究發現[5]，板栗殼中富含酚類、鞣質、有機酸、黃酮等物質，而酚類物質具有一定的抗氧化、抗肥胖、抗癌、抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化等特性，對人體健康有益[6]。因此板栗殼多酚具有較高的開發利用價值，在創造更高的經濟效益的同時，能減少環境污染和資源浪費。然而，使用傳統有機溶劑（如乙醇）或水提取板栗殼多酚，存在提取時間長、提取率低、能耗高等缺點[7]。

低共熔溶劑（Deep eutectic solvents，DESs）通常由氫鍵受體（Hydrogen bond acceptor，HBA）和氫鍵供體（Hydrogen bond donor，HBD）組成，具有低熔點、高熱穩定性、低毒性或無毒性、高生物降解性和低制備成本等特性。氯化膽堿（Choline chloride，ChCl）是最常用的HBAs 之一，天然初級代謝物（如糖、有機酸和胺類）是HBDs 的豐富來源[8]。目前，DESs 作為一種綠色、高效的有機溶劑替代品已被廣泛應用于各種天然產物的提取，包括酚類、黃酮類、蛋白質、多糖、蒽醌類、萜類、生物堿等[9-14]。超聲波輔助提取（Ultrasonic-assisted extraction，UAE）作為一種新型的有效萃取技術，不僅可以降低溶劑和能量的消耗，而且還可以縮短提取時間[15]，因此，UAE 的DESs 提取已成為植物組織中高效提取功能性成分的重要手段[6,8,16-17]。

基于以上現狀，本研究利用DESs-UAE 提取板栗殼中的多酚，篩選出最佳的DESs 溶劑，并采用響應面法優化最佳工藝條件，以實現板栗殼中酚類物質的高效快速提取，并對粗提物中酚類物質進行鑒定，旨在獲得一種綠色、高效提取板栗殼廢棄物中多酚的方法，以實現板栗殼廢棄物的資源化利用。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

板栗殼 購買于當地農貿市場；氯化膽堿（＞98.0%）、乙二醇（＞98.0%）、1,2-丙二醇（＞99.0%）、1,3-丁二醇（＞98.0%）、甘油（＞99.0%）、草酸（＞99.8%）、D-山梨醇（＞98.0%）、葡萄糖 Macklin 生化有限公司；Folin-Ciocalteu 試劑、沒食子酸標品、三種大孔樹脂（D-101，AB-8 和NKA-9）、尿素（＞99.5%）中國北京Solarbio 科技有限公司；HPLC 級甲酸Sigma-Aldrich 公司；MS 級乙腈 Fisher Scientific公司。

FW100 型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；SCIENTZ-IID 型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Centrisart D-16C 型高速離心機 德國Eppendorf 公司；TU-1901 型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；FTIR 光譜儀 美國Perkin-Elmer 公司；TripleTOF 5600+質譜儀 美國AB SCIEX 公司；Nexera UHPLC LC-30A UHPLC 色譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 板栗殼前處理 取板栗殼于50 ℃干燥，磨碎，過60 目篩，儲存在玻璃瓶內，放置于干燥器中，使用前干燥至恒重。

1.2.2 DESs 的制備 HBD 和HBA 按一定摩爾比混合，水浴80 ℃下攪拌1.5 h，直至形成均勻透明的液體，儲存在室溫下過夜[17]，使用前真空干燥24 h。本實驗合成8 種DESs，DESs 的編號、HBA、HBDs以及HBA 與HBD 的摩爾比如表1 所示。

表1 不同類型的DESsTable 1 Different systems of the prepared DESs

1.2.3 板栗殼多酚提取及提取溶劑選擇 稱取0.5 g板栗殼粉末，加入15 mL DESs（含水量20%，v/v）或水或40%乙醇于50 mL 離心管中，混勻，在室溫下超聲處理10 min，超聲功率200 W，超聲過程中實時檢測超聲溫度，控制其不超過55 ℃。之后10000×g離心10 min，取上清液，過0.22 μm 濾膜，備用。

1.2.4 總酚得率的計算 基于預實驗結果，DESs 不會干擾福林酚顯色反應。因此，本實驗采用福林酚法測定1.2.3 所得提取液中總酚含量[18]，按公式（1）計算總酚得率。取10 μL 提取液，加入一定量超純水進行稀釋，然后依次加入1 mL 福林酚試劑（1/10，v/v超純水稀釋）和1 mL Na2CO3溶液（10%，w/v，超純水溶解），定容至4 mL。在50℃下避光反應5 min，于765 nm 處測吸光度。以沒食子酸作為標準品，標準曲線為y=12.605x-0.1111（R2=0.9992）。總酚得率（mg/g）用沒食子酸當量表示，按照如下公式進行計算：

式中：Y 表示總酚得率，mg/g；C 表示所測吸光度值對應的標準曲線濃度，mg/mL；V0表示顯色反應液體體積，4 mL；V1表示提取樣品總體積，mL；V2表示用于顯色的提取液體積，mL；m 表示板栗殼質量，0.5 g。

1.2.5 DES-1 的傅里葉紅外變換光譜（FTIR）分析將氯化膽堿、草酸和DES-1 進行傅里葉紅外光譜掃描，掃描前將樣品置于烘箱中，55 ℃下干燥12 h，充分烘干以除去水分。掃描分辨率為4 cm-1，掃描波數范圍4000～400 cm-1，掃描32 次，并使用OMNIC 8.2 軟件對數據進行分析。

1.2.6 多酚提取工藝優化

1.2.6.1 單因素實驗 采用1.2.3 方法提取多酚，以DES-1 為提取溶劑，固定液固比30:1 mL/g、超聲波功率200 W、超聲波時間10 min，考察水分含量（0、20%、30%、40%、50%）對總酚得率的影響；固定超聲波功率200 W、水分含量20%、超聲波時間10 min，考察液固比（20:1、30:1、40:1、50:1、60:1 mL/g）對總酚得率的影響；固定水分含量20%、液固比30:1 mL/g、超聲波時間10 min，考察超聲波功率（250、300、350、400、450 W）對總酚得率的影響；固定水分含量20%、超聲波功率200 W、液固比30:1 mL/g、超聲提取時間（2、5、10、15、20 min）對總酚得率的影響。

1.2.6.2 響應面試驗優化工藝 在單因素實驗的基礎上，用響應面分析法進一步優化提取工藝參數。依據Design-Expert 8.0 軟件中Box-Behnken 的實驗設計原理見表2，以總酚得率為響應值，確定最佳提取條件。

表2 優化方案的因素水平設計Table 2 Factors and levels in the optimal scheme

1.2.7 大孔吸附樹脂純化多酚

1.2.7.1 樹脂活化 大孔吸附樹脂活化參考Wang等[8]方法稍并做修改。分別稱取D-101（非極性）、AB-8（弱極性）和NKA-9（極性）大孔吸附樹脂15 g，用超純水沖洗，除去白色漂浮物，濾紙吸走樹脂水分，再用無水乙醇浸泡24 h，超純水沖洗至沖洗液無白色渾濁；4% HCl 浸泡5 h，超純水沖洗至中性；4%NaOH 浸泡5 h，超純水清洗至中性，濾紙吸去樹脂表面水分。

1.2.7.2 吸附與洗脫 將活化后的大孔吸附樹脂以95%乙醇濕法上柱，浸泡24 h。然后用超純水洗凈乙醇，浸泡4 h 后備用。將2 mL 多酚提取液過層析柱，未吸附的部分使用200 mL 超純水沖洗，而后用95%（v/v）乙醇洗脫至無色，將洗脫液收集。將洗脫液進行45 ℃恒溫旋轉蒸發濃縮。用超純水定容至10 mL，測定總酚含量，計算回收率。

式中：m1表示洗脫液中總酚量，mg；m2表示2 mL 上樣中總酚量，mg。

1.2.8 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 分析 基于響應面優化的實驗條件，提取多酚并用AB-8 大孔吸附樹脂進行回收，過0.22 μm 濾膜，進一步通過UHPLCQ-TOF-MS/MS 進行定性分析。色譜條件如下：島津InerSustain C18反相色譜柱（100 mm×2.1 mm，2 μm），柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量2 μL，流動相A、B 分別為0.1%甲酸水溶液與乙腈；梯度洗脫（0～2 min，5% A；2～4 min，5%～20% A；4～12 min，20%～25% A；12～14 min，25%～46% A；14～26 min，46%～100% A；26～28 min，100% A；28～29 min，100%～5% A；29～30 min，5% A）。通過Q-TOF-MS/MS 定性分析洗脫液中酚類物質的種類，質譜條件為：電噴霧離子源（ESI），正負離子模式掃描，噴霧電壓為5500/-4400 V，正、負離子源溫度分別為500、450 ℃，去簇電壓為60 V/-60 V，氣簾氣25 psi，霧化氣50 psi，輔助加熱氣50 psi，離子掃描范圍為m/z 50～1000，累積時間為10 ms，碰撞能量為20～50 eV，通過IDA模式獲得質譜數據。通過分析MS/MS 離子碎片，并結合數據庫（MassBank、Respect、GNPS）與相關文獻報道，鑒定提取物中酚類物質的種類。

1.3 數據處理

實驗結果采用SPSS Statistics 17.0 軟件進行統計分析，采用Design expert 8.0.6 軟件進行回歸分析。數據用平均值±標準誤差（Mean±SD）表示，采用單因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA）中Duncan 多重比較分析組間差異性。

2 結果與分析

2.1 最適低共熔溶劑選擇

本實驗以ChCl 為HBA，以有機酸、糖、胺和多元醇為HBDs，按不同的摩爾比合成了8 種不同類型的DESs。所制備的DESs 在室溫下均呈透明液體狀，考慮到DESs 的高粘度，在進行多酚的提取時所使用的DESs 含水量為20%（v/v）。不同種類DESs對板栗殼多酚得率如圖1 所示。

圖1 不同溶劑對板栗殼多酚得率的影響Fig.1 Effect of different solvents on the extraction yield of phenolic compounds from chestnut shells

在8 種DESs 中，氯化膽堿:草酸=1:1 合成的DES-1 提取效果最好，為65.8±2.1 mg/g。可能原因是依據相似相溶原理，極性較強的DESs 適用于提取較強極性化合物，而極性較弱的DESs 適用于提取弱極性化合物[6]，與胺基、糖基以及多元醇基DESs 相比，草酸基DESs 的極性更強，更適宜于提取多酚這種極性較強的化合物；此外，羧酸基DESs 的酸性環境更有利于維持多酚的結構不被破壞[19]，從而增大總酚得率。值得注意的是，DES-1 的總酚得率顯著高于水和40%乙醇（P＜0.05），分別是水和40%乙醇的3.2 和1.8倍，可能是由于DES-1 能與多酚之間形成更強的氫鍵作用[8]，從而促進提取，這與之前的報道相一致[20-21]。這些結果表明DES-UAE 法是一種較好的從板栗殼中提取多酚的方法。因此，選擇氯化膽堿:草酸=1:1 制備的DES-1 用于后續提取工藝的優化。

2.2 DES-1 的FTIR 表征

對氯化膽堿、草酸以及制備的DES-1 進行了FTIR光譜表征，以證實氯化膽堿與草酸之間存在氫鍵作用，因為氫鍵是DESs 具有較高增溶能力的重要原因。氯化膽堿、草酸與DES-1 的紅外譜圖如圖2 所示。

圖2 氯化膽堿、草酸以及DES-1 的紅外譜圖Fig.2 Infrared spectra of choline chloride,oxalic acid and DES-1

由譜圖可知：對于氯化膽堿，3264 cm-1處的特征峰為O-H 伸縮振動，1480 cm-1處的特征峰為CN 伸縮振動[22]。對于草酸，O-H 伸縮振動表現為以3017 cm-1為中心的寬譜帶，是由于草酸C=O 和OH 基團之間形成了分子間氫鍵[23]；1732 cm-1處特征峰為C=O 伸縮振動；1234 cm-1處的特征峰為C-O伸縮振動。與氯化膽堿的氫鍵區域相比，DES-1 氫鍵區域的峰形發生改變，由原來的尖峰變為寬譜帶，表明在合成DES-1 時，ChCl 和草酸之間形成氫鍵。此外，在DES-1 光譜中觀察到ChCl 和草酸的特征峰，表明ChCl 的C-N、草酸的C-N 鍵在反應過程中保持穩定。以上結果表明成功合成了DES，且氯化膽堿與草酸之間存在氫鍵相互作用。

2.3 單因素實驗

2.3.1 水分含量的影響 DESs 可與水互溶，水的加入會改變DESs 的理化性質，尤其改變DESs 的黏度與極性。當前研究表明，水的加入可能促進或抑制DESs 的提取性能[24]。因此，探究水分含量對總酚得率的影響是必要的。由圖3 可知，在無水條件下，總酚得率最低，當水分含量增加到30%時，總酚得率隨水分含量的增加而增大，在含水量為30%時總酚得率達到最大，主要原因可能是水分的加入會明顯降低DESs 的粘度。Huang 等[25]研究發現，在氯化膽堿:丙三醇=1:1 制成的DES 中加入5%（w/w）的水時，體系黏度可降低20%；加入20%的水時，體系黏度可降低至1/80。除此之外，研究表明，適當降低黏度可以有效提高傳質速率，促進提取物的溶出，增大總酚得率[26]。然而，進一步增加含水量至50%，總酚得率隨著水分含量的增加而減少，可能原因是加入過量的水分會減弱甚至破壞HBD 和HBA 之間的氫鍵相互作用，進而破壞DESs 的超分子結構，使得有效溶劑DESs 的含量降低，導致總酚得率降低。因此，選用水分含量20%、30%、40%進行后續優化試驗。

圖3 水分含量對得率的影響Fig.3 Effect of water content on the yield

2.3.2 液固比的影響 液固比是萃取過程中不可缺少的因素。如圖4 所示，當液固比從20:1 mL/g 增加到40:1 mL/g 時，總酚得率隨液固比的增加而增加，可能是因為提取溶劑較少時，板栗殼原料與提取溶劑的接觸不足，導致提取不充分[6]。隨著液固比的增加，提取溶劑體積增加而充分浸提，從而提高總酚得率。當液固比繼續增加時，總酚得率隨液固比的增加而降低，這可能是由于液固比過大，加入過多的溶劑會消耗超聲波一定的能量，導致總酚得率下降[27]。因此，選用液固比30:1、40:1、50:1 mL/g 進行后續優化試驗。

圖4 液固比對得率的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the yield

2.3.3 超聲波功率的影響 如圖5 可知，當超聲波功率從200 W 增加到350 W 時，總酚得率隨超聲功率的增加而增加，這可能因為增大功率加強了超聲波的破壁效果，促進了內容物的釋放。當繼續增加超聲波功率至450 W 時，總酚得率隨超聲波功率的增大呈現明顯降低的趨勢，可能原因是，超聲功率過大，產生的熱效應會破壞部分多酚，使得總酚得率降低[28]。因此，選用超聲波功率300、350、400 W 進行后續優化試驗。

圖5 超聲波功率對得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the yield

2.3.4 超聲波時間的影響 超聲波的處理時間也是影響提取效率的重要因素。由圖6 可知，在10 min以內，隨著時間的延長，總酚得率升高，但進一步延長處理時間時，提取效率增加的幅度較小。10 min 的提取時間足夠將大部分的多酚從板栗殼基質材料中提取出來，而過長的時間處理又會使得時間和經濟成本增加且提升的效果不顯著（P＞0.05），因此選擇超聲波處理10 min 進行后續實驗。

圖6 提取時間對得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on the yield

2.4 響應面結果分析

2.4.1 模型顯著性分析 在單因素實驗的基礎上，采用響應面分析的BBD（三因素三水平）設計對多酚的提取工藝進行優化，得到最佳工藝條件，進一步得出預測值并建立回歸模型。實驗條件以及結果如表3所示，方差分析的結果和回歸模型如表4 所示。

表3 Box-Behnken 響應面試驗設計與結果Table 3 Design and results of Box-Behnken response surface experiment

表4 回歸模型方差分析Table 4 ANOVA for response surface regression mode.

采用F檢驗和P值對模型的顯著性進行評價。較高的F值（105.63）和較低的P值（＜0.0001）表明回歸模型顯著，因此認為該模型適合預測多酚的提取。模型失擬項P值為0.3602，大于0.05，不具有顯著性差異。回歸系數（R2=0.9748）、回歸模型的調整系數（R2Adj=0.9854）和精密度（29.104）共同表明模型具有較高的精度和可靠性，表明預測值與實驗值之間具有很高的相關性[29]。與此同時，一次項X2、X3以及平方項X21、X22和X23均影響極顯著（P＜0.01），交互項X1X3影響顯著（P＜0.05）。綜上結果表明，該模型能充分且準確反映板栗殼總酚得率與自變量之間的真實關系。

得到描述模型的二階多項式方程如下：

2.4.2 交互作用分析 3D 響應曲面圖和熱圖可以直觀反映超聲波功率、液固比和水分含量對多酚總酚得率的交互作用顯著程度[30]。如圖7 所示，在3D 圖中，曲面的坡度越大，越靠近曲面頂端顏色越深，表明兩個變量之間的交互作用越顯著。在熱圖中，等高線形狀越接近圓形則交互作用越不顯著，越接近橢圓則交互作用越顯著。因此，結合表4 可知，只有超聲波功率和水分含量的交互作用具有顯著性影響，其余均不顯著。

圖7 3D 響應曲面圖和熱圖Fig.7 3D response surface diagram and heat diagram

2.4.3 響應面優化和模型驗證 經過響應面優化確定了多酚的最佳提取條件為：超聲波功率348.11 W、液固比42.47:1 mL/g、水分含量32.29%，總酚得率為99.44 mg/g，為了實驗的方便以及儀器的精確度，將最優條件調整為：超聲波功率348 W、液固比42:1 mL/g、水分含量32%，實驗重復3 次。在此最優條件下，實測總酚得率為99.66±2.63 mg/g，實驗值與預測值相接近（誤差3.34%＜5%），驗證了該模型對多酚的提取具有良好的預測能力。

2.5 大孔吸附樹脂純化

因為DESs 具有較高的水混溶性和極低的揮發性，所以從DESs 萃取物中回收萃取的目標化合物回收困難[25]。大孔吸附樹脂法具有吸附速度快、吸附量大、耗能少、可重復使用等優點，在提取物純化領域中應用較廣泛。通過比較得出3 種不同極性樹脂的回收性能結果，如表5 所示，AB-8 樹脂的多酚回收率最高，達到97.92%±1.78%，因此認為AB-8 樹脂是從DESs 提取物中回收多酚的理想樹脂。相比AB-8，D-101 和NKA-9 樹脂的回收率較低，分別為85.12%±2.07%和86.14%±3.55%。當樹脂的極性與目標化合物的極性接近時，就會表現出較強的吸附能力。本實驗AB-8 樹脂屬于弱極性樹脂，極性可能與多酚的極性最類似，有利于最大程度表現出對多酚的強吸附性能[8]。因此，采用AB-8 大孔吸附樹脂可以簡便且高效地從DESs 粗提物中回收多酚。

表5 不同大孔吸附樹脂對板栗殼多酚的回收率Table 5 Recoveries of polyphenols from chestnut shells by different macroporous resins

2.6 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 分析

本實驗通過UHPLC-Q-TOF-MS/MS 初步鑒定了13 種酚類化合物。所鑒定的酚類化合物的質譜數據及相關信息如圖8 和表6 所示。通過與數據庫以及相關文獻相對比，共鑒定出兩類酚類化合物：黃酮類（或類黃酮衍生物）和酚酸類。黃酮類化合物（或類黃酮衍生物）包括槲皮素-3-O-葡萄糖苷[31]、異鼠李素-3-O-半乳糖苷[31]、原花青素二聚體[32]、花青素[32]、花旗松素[32]、兒茶素[32]、橙皮苷[33]、異鼠李素[34]、百里香酚-β-D-葡萄糖苷、棕矢車菊素、表兒茶素沒食子酸酯和黃芩苷4 ' -甲基醚，相比之下，只鑒定出一種酚酸（對羥基苯甲酸）。其中，原花青素二聚體和兒茶素具有較大的峰面積。這些結果進一步證實了UAE 輔助DESs 萃取法是一種有效的提取酚類化合物的方法。

圖8 板栗殼多酚的總離子流圖Fig.8 Total ion current chromatograms of phenolic compounds from chestnut shells

表6 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 酚類物質鑒定結果Table 6 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS identification results of phenolic compounds

3 結論

本文采用低共熔溶劑-超聲波輔助提取板栗殼廢棄物中的多酚，以氯化膽堿-草酸（摩爾比為1:1）合成的DES-1 為最佳提取溶劑，FTIR 表征氯化膽堿和草酸之間氫鍵的形成。采用單因素實驗和響應面分析進行提取工藝優化，將得到的提取物進行大孔吸附樹脂回收，同時進行酚類物質的鑒定。優化的最佳提取工藝條件為：超聲波功率348 W、液固比42:1 mL/g、水分含量32%，在此最優條件下總酚得率為99.66±2.63 mg/g，AB-8 大孔吸附樹脂多酚回收率達到97.92%±1.78%，并初步鑒定出兒茶素、原花青素二聚體等13 種酚類物質。DESs 提取板栗殼多酚的效果明顯高于傳統溶劑（水和乙醇），為板栗殼多酚的綠色高效提取、創造更高經濟價值提供了理論依據。但本實驗僅對提取條件進行優化并進行多酚成分鑒定，未來還需要對各種酚類物質進行準確定量、分離純化以及生物活性驗證等。