老年血液透析患者血清miR-21與T細胞相關

王 珊，楊華昱，孫 穎，馬 清

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院 老年醫學科， 北京 100050)

隨著老齡化社會的到來，進展到尿毒癥的老年慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者逐步增多。血液透析是治療尿毒癥的有效手段，近來有研究表明，維持性血液透析(maintenance hemodialy-sis，MHD)可以清除尿毒癥患者體內大部分毒素，但血液透析本身卻刺激氧化應激和誘發微炎性反應(microinflammation)狀態[1]，最終增加心血管疾病、感染的患病率和癌癥風險[2]。在研究中發現，MHD患者較健康人群存在明顯的免疫功能障礙，出現單核細胞的促炎表型[3]、CD4+/CD8+細胞比例倒置等情況，從而增加發生膿毒癥的概率[4-5]。MicroRNAs(miRNAs)是一種小的非編碼RNA，主要通過結合至靶mRNA從而抑制蛋白翻譯或促進mRNA降解來調控基因的轉錄后表達[6]。研究發現血清miRNAs是免疫系統的重要調節因子，可以調控免疫細胞中相關基因的變化，從而調控體內穩態的變化[7]。老年MHD患者出現致命性感染性疾病的可能性更大，但關于老年MDH患者微炎性反應、體內免疫功能情況和miRNAs之間相關性的研究較少，為進一步探討老年MDH患者的免疫功能和miRNAs譜的變化，本研究除常規檢測患者的外周血T淋巴細胞亞群情況、炎性指標與miRNAs的變化情況，還分析了老年MDH患者透析前后CD4+和Treg細胞百分率、miR-21相對表達量之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：本研究中的觀察組為2020年1月至2021年1月在北京友誼醫院老年醫學科血液透析室就診的28例老年MDH患者。納入標準：1)年齡≥65歲；2)于北京友誼醫院進行規律血液透析時間長于1年。排除標準：1)存在急性感染、外科創傷等急性疾病；2)存在肝功能衰竭、惡性腫瘤晚期、血液病等疾病。以上患者的平均透析時間為(4.3±2.6)年。在“透析前后血清miR-21表達水平與CD4+、Treg 及Treg/CD4+的相關性分析”研究部分，收集了觀察組中21例患者透析前后的血液樣本，另7例患者未采集透析后血液樣本。

同時，選取2020年1月至2021年1月在北京友誼醫院老年醫學科體檢進行健康體檢的65歲以上老年人群作為對照組，共有47例。排除標準：1)存在3期及以上分期的CKD；2)曾進行腎切除，或患有腎小球腎炎、IgA腎病等腎臟疾病；3)存在急性感染、外科創傷等急性疾病；4)存在肝功能衰竭、惡性腫瘤晚期、血液病等疾病。本文研究通過北京市友誼醫院倫理委員會批準(審批文號：2022-P2-120-01)，本研究程序均符合醫院倫理委員會制訂的倫理學標準。

1.1.2 試劑：Trizol試劑、miRNAs及對照引物序列(Invitrogen公司)，引物序列見表1；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒(Transgene公司)；SYBR預混試劑(TaKaRa公司)； miRcute Plus miRNA定量PCR檢測試劑盒(天根生化科技有限公司SYBR?Green)；人淋巴細胞分離液(達科為公司優達?)；CD3、CD4、CD8、CD56、CD16、CD25、CD127 (IL-7Rα)抗體(Biolegend公司)；流式細胞儀(賽默飛公司Attune?NxT流式細胞儀)。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification

1.2 方法

1.2.1 治療方法：入組的MHD患者均應用德國費森血液透析機(型號4008S)進行常規血液透析治療，頻率為每次4 h，每周3次。血液透析過程所用濾器為FX80高通量透析器(型號4008S)，透析膜表面積為1.8 m2，超濾系數40 mL/(h×mmHg)(1 mmHg=0.133 kPa)，血流速在200～250 mL/min，透析液流量500～700 mL/min。

1.2.2 標本采集和指標檢測：本研究中MHD組患者在血液透析治療前和治療結束時采集血樣，對照組均在入組后當天或次日空腹時采集血樣。 之后在本院化驗室測定血常規、血糖、肝腎功能、C反應蛋白(CRP，C-reactionprotein)、白介素-6(IL-6，interleukin-6)等實驗室資料[8]。

1.2.3 外周血T淋巴細胞檢測：MHD組和對照組采樣時間同前，采集外周血3～4 mL，加入等體積淋巴細胞分離液、1×PBS，離心30 min后吸取白膜層，用1×PBS重復洗滌2次后制成1×107個/mL單個核細胞的混懸液，每個樣本各取100 μL分別放入兩個試管，加入5 μL Human TruStain FcX抗體孵育10 min，之后分別加入相應表面抗體各2 μL[即CD3+、CD4+、CD8+、CD56+、CD16+抗體，或CD3+、CD4+、CD25+、CD127(IL-7Rα)抗體]混勻后避光孵育20 min，離心洗滌細胞后加入500 μL 2%多聚甲醛重懸染色細胞并室溫靜置20 min后上機檢測。之后利用Attune? NxT流式細胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+、CD3-CD56+CD16+自然殺傷細胞(natural killer cell，NK細胞)、CD4+CD25+CD127-調節性T細胞(regulatory T cells, Treg細胞)，所有操作步驟嚴格按照說明書執行。

1.2.4 反轉錄和實時定量PCR：抽取兩組人群外周血5 mL，分離血清，先用Trizol試劑提取總RNA，然后利用cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒進行反轉錄，使用SYBR預混試劑及ABI7500定量PCR儀進行定量PCR擴增，以人snRNA U6 (human snRNA U6)為內參，PCR引物序列見表1。采用2-△△Ct的方法對實時定量PCR的結果進行分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 25.0統計學軟件進行數據分析，應用均數±標準差(x±s)表示計量資料數據，采用t檢驗進行兩組間比較；計數資料用率表示，采用χ2檢驗進行組間比較，利用Pearson相關分析比較兩種參數之間的相關性，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

分析觀察組和對照組的基線資料，可看出兩組人群在年齡上無統計學差異，血液透析患者的收縮壓較對照組明顯增高，血紅蛋白、谷丙轉氨酶、白蛋白水平均偏低(P<0.001)，而估算腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)明顯偏低，尿素氮水平明顯增高(P<0.001)，差異具有統計學意義(表2)。

表2 觀察組和對照組的基本情況Table 2 Characteristics between observation group and the control group(x±s)

2.2 老年MHD患者外周血淋巴細胞亞群比例、炎性指標和miRNAs相對表達量

老年MHD患者透析前的CD4+淋巴細胞和Treg細胞的百分比較對照組明顯增高(P<0.001)， 中性粒細胞百分比、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、C反應蛋白(C-reactionprotein，CRP)等炎性指標也較對照組明顯增高(P<0.001)。同時，老年MHD患者透析前miR-21-5p的相對表達量較對照組有所增高(P<0.05)(表3)。

表3 觀察組和對照組外周血T淋巴細胞亞群比例以及炎性指標、miRNAs表達量比較Table 3 Percentage of T lymphocyte subsets, and expres-sion of inflammatory indicators and miRNAs in peripheral blood between observation group and control group

2.3 老年MHD患者透析前后miR-21相對表達量、Treg細胞和CD4+淋巴細胞比率的變化

收集觀察組中21例患者透析前后的血液樣本，發現血液透析后eGFR、尿素氮、血磷、血鉀水平明顯下降(P<0.001)，血鈣水平有所增高(P<0.001)。尿素下降率(urea reduction ratio，URR)的中位數為72.3(68.1，74.2)，尿素清除指數(Kt/V)的中位數為1.32(1.25，1.41)，透析充分性良好。透析后miR-21相對表達量和Treg細胞的比率均有所增高(P<0.05)(表4)。

表4 血液透析前及血液透析后MHD患者一般情況變化Table 4 Characteristics of the MHD patients before and after dialysis

2.4 老年MHD患者透析前后血清miR-21表達水平與CD4+、Treg 及Treg/CD4+的相關性分析

利用Pearson相關分析老年MHD患者透析前和透析后血清miR-21相關表達量，分別與外周血CD4+、Treg細胞比率之間的相關性，發現血清miR-21相關表達量在透析后與CD4+淋巴細胞比率呈正相關(相關系數r=0.867，P=0.039)。而透析前后血清miR-21相關表達量均與Treg細胞比率呈正相關(血液透析前r=0.5，P=0.021，血液透析后r=0.532，P=0.015)(P<0.05)，均具有統計學意義，且透析后兩者相關性更加顯著(表5)。

表5 血液透析前后miR-21相對表達量以及CD4+、Treg細胞比率比較Table 5 Expression of miR-21 and percentage of CD4+ and Treg cell in peripheral blood before and after dialysis

3 討論

流行病學調查報告顯示中國CKD患病率高達10.8%[9]，而老年人CKD的患病率可高達23.4%～35.8%[10]。老年CKD患者進展至終末期腎病的發病率也逐漸增高，目前已成為一項嚴重的社會公共衛生問題。血液透析可有效清除體內毒素和調節電解質紊亂。隨著血液透析方式的不斷更新，MHD患者長期存活率明顯增加，也加大了老年MHD患者數量和比例，但隨之而來的微炎性反應狀態誘發的致命性感染疾病比例逐步增多，嚴重影響預后。因此，如何評估老年MHD患者的炎性反應狀態和免疫功能情況顯得尤為重要。

既往多項研究顯示終末期腎病患者存在免疫功能紊亂，認為與尿毒癥血清中較高水平的促炎細胞因子有關，當血液在透析膜中流動時會引起以中性粒細胞和單核細胞募集為特征的異物反應，從而釋放促炎細胞因子，導致機體長期處于微炎性反應狀態，主要體現在IL-6、TNF-α及CRP水平明顯增高[11]。本研究結果顯示老年MHD患者的中性粒細胞百分比、IL-6、CRP明顯增高，且存在血紅蛋白、白蛋白水平下降，均提示存在微炎性反應狀態，有營養不良風險。Treg細胞是免疫穩態的重要貢獻者，其調節失調可導致免疫耐受喪失和自身免疫性疾病。本研究發現入組的老年MHD患者透析前CD4+T細胞和Treg細胞的百分比率較對照組明顯增高，說明老年MHD患者體內存在微炎性反應狀態，從而刺激CD4+細胞和調節性T細胞的生成。對老年MHD患者的透析前后血樣進行比對發現，入組的老年MHD患者透析充分性良好，Treg細胞比率有所增加，說明經血液透析后患者免疫功能略有恢復。

有研究發現血液透析后血清中miR-499、miR-21-5p、miR-210等相對表達量上調[12]。本研究揭示老年MHD患者透析前miR-21-5p相對表達量較對照組增高，且透析后miR-21-5p的相對表達量有所上調，這與既往研究相同。既往多個研究發現，miR-21-5p表達上調促使白細胞數量增加，同時引起TNF-α、IL-6等炎性因子的釋放[13]。本研究發現透析前后miR-21表達量與Treg細胞比率呈正相關，推測miR-21-5p表達上調可引起Treg細胞的增多，進一步支持miRNAs參與血液透析過程中免疫功能的調節，這可能為利用miRNAs評估老年MHD微炎性反應狀態和免疫功能情況提供新的方向。