5-氮雜-2’-脫氧胞苷對高糖培養的NRK-52E細胞中分泌型卷曲相關蛋白1表達的影響

田平平，寧 潔，鄒 琴，盧雨微，郭 兵，石明雋*

(1.新鄉醫學院 三全學院 擴理學院，河南 新鄉 453003；2.貴州醫科大學 病理生理學教研室，貴州 貴陽 550025;3.貴州省常見慢性疾病發病機制及藥物研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

腎臟纖維化是慢性腎臟疾病發展的常見病理過程。各種致病因素刺激使腎臟細胞不斷分泌炎性介質及細胞因子等，促進細胞外基質(extracellular matrix, ECM)的分泌與沉積，最終引起腎臟結構和功能的改變[3]。

分泌型卷曲相關蛋白1(secreted frizzled-related protein 1, Sfrp1)屬于分泌型糖蛋白。本課題組研究發現，在糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)大鼠腎組織中，Sfrp1表達減少可能參與腎臟纖維化的發生[4]。也有研究發現，Sfrp1甲基化與多種腫瘤的發生密切相關，其中DNA甲基化轉移酶(DNA methyltransferase，Dnmts)扮演著重要角色[5-6]。Dnmts共包含Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3l 5個成員。在哺乳動物中，參與甲基化調節的主要有Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b[7]。5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine, 5-Aza-CdR)是一種DNA甲基轉移酶抑制劑，可共價結合Dnmts，調節基因表達。

本研究擬從體外水平，利用5-Aza-CdR干預NRK-52E細胞，觀察Sfrp1、Dnmt3a、Dnmt3b、col-Ⅲ及col-Ⅳ在各組細胞中的表達變化，探討Dnmt3a、Dnmt3b、col-Ⅲ及col-Ⅳ與Sfrp1的關系以及Sfrp1在DN腎臟纖維化發病中的作用及意義，為DN的治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物：清潔級雄性SD大鼠16只，體質量(180±20)g[遼寧長生生物技術有限公司，生產許可證號：SCKK(遼)2015-0001]。

1.1.2細胞：大鼠近端腎小管上皮細胞系(NRK-52E細胞)，購于美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。

1.1.3試劑及試劑盒：鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)，5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-2’deoxycytidine, 5-Aza-CdR)，小鼠抗大鼠col-Ⅳ單克隆抗體(Sigma-Aldrich公司)；兩步法免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)；胎牛血清、DMEM培養基和0.25%胰蛋白酶(Gibco Introvagen公司)；蛋白提取試劑盒 (北京索萊寶公司)；小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(武漢普美克生物技術有限公司)；兔抗大鼠Dnmt3a、Dnmt3b、Sfrp1和col-Ⅲ多克隆抗體 (北京博奧森公司)；Trizol Regent(Ambion 公司)；Sfrp1和β-actin引物(上海生工生物技術工程服務有限公司)；Revert AidTMFirststrand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific公司)；2×SuperReal PreMix Plus(天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 DN模型大鼠復制：模型復制方法參照文獻[1-2]。造模前禁食6～8 h，DN組尾靜脈注射STZ 55 mg/kg，NC組尾靜脈注射等量的無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后尾靜脈采血檢測各組大鼠血糖值，以血糖值≥16.7 mmol/L為糖尿病動物模型(DM模型)大鼠復制成功。1周后，對各組大鼠行尿蛋白定性檢測，結果陽性視為DN模型構建成功。10周后乙醚麻醉大鼠，處死前1 d稱重，留取24 h尿液；股動脈穿刺采血，離心后取血清；0.9% NaCl沖洗腎臟至蒼白色，稱重并記錄腎重(mg)/體質量(g)比值即腎臟指數(kidney index, KI)；一側腎臟固定于4%中性甲醛溶液中行病理學相關檢測；另一側腎于-80 ℃保存備用。

1.2.2 生化指標的檢測：氧化酶法測血清葡萄糖(blood glucose, BG)濃度；鄰苯三酚比色法測尿蛋白濃度，尿蛋白濃度與24 h尿量乘積為24 h 尿蛋白(24 h urine protein, 24 h UP)；酶分析法檢測血清肌酐水平。

1.2.3 免疫組織化學染色：按照免疫組織化學染色說明書進行：脫蠟、水化、阻斷內源性過氧化物酶、抗原修復、滴加一抗、二抗孵育、DAB顯色、復染、梯度乙醇脫水。自然晾干后，用二甲苯稀釋后的中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并拍照保存。

1.2.4 細胞的分組：待NRK-52E細胞增殖匯合度至90%時，棄上清，0.25%胰蛋白酶消化，待細胞變圓加入DMEM培養基，吹打均勻，離心，加培養基重懸。將NRK-52E細胞隨機分為正常糖組(NG，葡萄糖5.5 mmol/L)、高糖組(HG，葡萄糖30 mmol/L)和高糖加5-Aza-CdR (80 μmol/L)組(5-Aza-CdR組)，3組細胞置37 ℃、5% CO2溫箱培養48 h，提取蛋白和RNA備用。

1.2.5 Western blot檢測蛋白：用BCA蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度，制備上樣蛋白樣品，SDS-PAGE分離，并轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗孵育，濃度分別為β-actin(1∶4 000)、Dnmt3a(1∶500)、Dnmt3b(1∶500)、Sfrp1(1∶500)、col-Ⅲ(1∶500)及col-Ⅳ(1∶1 000)；4 ℃冰箱孵育過夜；1%脫脂牛奶配置的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后，ECL 液顯色，Bio-Rad凝膠成像系統掃描檢測PVDF膜上的目的蛋白曝光度，Image Lab 5.1圖像分析軟件分析蛋白信號的相對含量，以β-actin為內參，計算各目標蛋白的相對含量。

1.2.6 RT-qPCR檢測mRNA:Trizol法提取各組NRK-52E細胞總RNA，按照RevertAidTMFirststrand cDNA Synthesis Kit說明書反轉錄cDNA，按照Talent qPCR PreMix(SYBR Green)說明書行RT-qPCR，引物序列見表1。mRNA的相對表達量用2-△△Ct方法分析。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Sequence of primers used in RT-qPCR

1.3 統計學分析

SPSS17.0和GraphPad Prism5統計軟件，數據以均數±標準差(x±s)表示，兩組間比較先進行正態性檢驗，再采用獨立樣本t檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析。

2 結果

2.1 各組大鼠腎臟指數及相關生化指標

與NC組比較，DN組大鼠KI較高(P<0.05)；DN組大鼠BG、24 hUP、肌酐水平較NC組升高(P<0.05)(圖1)。提示DN模型大鼠復制成功。

*P<0.05 compared with NC group圖1 兩組大鼠KI、BG、24 h UP、肌酐水平比較Fig 1 Comparison of kidney index, blood glucose, 24 h urinary protein and creatinine levels between the two groups of rats(x±s,n=8)

2.2 免疫組織化學檢測結果

可清晰檢測出Sfrp1蛋白在腎臟組織中的表達位置和表達量。可見Sfrp1蛋白陽性表達呈棕紅色，細胞核呈藍色。結果顯示，NC組Sfrp1陽性表達主要分布于腎小管上皮細胞，而DN組大鼠Sfrp1表達不明顯(圖2)。

圖2 兩組大鼠腎臟組織中Sfrp1的表達Fig 2 Expression of Sfrp1 in kidney tissues between the two groups of rats

2.3 5-Aza-CdR干預高糖培養的NRK-52E細胞后，Sfrp1表達恢復

與NC組比，HG組Sfrp1蛋白表達減少(P<0.05)，而給予5-Aza-CdR干預后，Sfrp1蛋白表達較HG組增多(P<0.05)(圖3)。RT-qPCR結果與蛋白表達水平結果趨向一致(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with NC group; #P<0.05 compared with HG group圖3 各組細胞中Sfrp1蛋白表達量的比較Fig 3 Comparison of Sfrp1 protein expression in each group(x±s,n=3)

*P<0.05 compared with NC group; #P<0.05 compared with HG group圖4 各組細胞中Sfrp1 mRNA 表達量的比較Fig 4 Comparison of Sfrp1 mRNA expression in each group(x±s,n=3)

2.4 5-Aza-CdR干預高糖培養的NRK-52E細胞后，Dnmt3a和Dnmt3b蛋白表達減少

與NC組比，HG組Dnmt3a和Dnmt3b蛋白表達增多(P<0.05)，而與HG組比，5-Aza-CdR組Dnmt3a和Dnmt3b蛋白表達減少(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with NC group; #P<0.05 compared with HG group圖5 各組細胞中Dnmt3a、Dnmt3b蛋白表達量的比較Fig 5 Comparison of Dnmt3a, Dnmt3b protein expression in each group(x±s,n=3)

2.5 5-Aza-CdR干預高糖培養的NRK-52E細胞后，col-Ⅲ和col-Ⅳ蛋白表達減少

與NC組比，HG組col-Ⅲ和col-Ⅳ蛋白表達增多(P<0.05)；而與HG組比，5-Aza-CdR組col-Ⅲ和col-Ⅳ蛋白表達減少(P<0.05)(圖6)。

*P<0.05 compared with NC group; #P<0.05 compared with HG group圖6 各組細胞中相關蛋白表達的比較Fig 6 Comparison of related proteins expression in each group(x±s,n=3)

2.6 Sfrp1與Dnmt3a、Dnmt3b、col-Ⅲ及col-Ⅳ蛋白表達量呈負相關

腎小管上皮細胞中Sfrp1與Dnmt3a(r=-0.937，P<0.05)、Dnmt3b(r=-0.965，P<0.05)、col-Ⅲ(r=-0.694，P<0.05)及col-Ⅳ(r=-0.888，P<0.05)均呈負相關(圖7)。

3 討論

隨著全球人口老齡化的加速，DM已成為影響人類健康的重大問題。DN是DM的主要微血管并發癥。研究表明，表觀遺傳機制所介導的基因調控與DN的發生發展密切相關[8-9]。表觀遺傳學涉及DNA甲基化、組蛋白修飾、微小RNA、染色質重塑等[10]。近年來DNA甲基化受到研究者的廣泛關注。

Dnmts是DNA甲基化過程中的關鍵酶，通過其催化作用參與DNA甲基化修飾[11-12]。在哺乳動物中，Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b具有催化活性，其異常表達可影響DNA甲基化水平和后期轉錄合成[4]。本課題組前期研究結果發現[7]，在糖尿病腎臟疾病大鼠腎組織中， Dnmt1、 Dnmt3a、 Dnmt3b、 Dnmt3l表達增高。其中，Dnmt3a和Dnmt3b與Sfrp1的相關性更明顯。本次體外實驗結果顯示Dnmt3a、Dnmt3b與Sfrp1呈負相關，與前期結果一致。

A.correlation between Sfrp1 and Dnmt3a; B.correlation between Sfrp1 and Dnmt3b; C.correlation between Sfrp1 and col-Ⅲ; D.correlation between Sfrp1 and col-Ⅳ圖7 Sfrp1與Dnmt3a、Dnmt3b、col-Ⅲ、col-Ⅳ蛋白表達相關Fig 7 Correlation between Sfrp1 and protein expression of Dnmt3a, Dnmt3b, col-Ⅲ and col-Ⅳ

研究發現[13-14]，Sfrp1在直腸癌、腎癌等腫瘤疾病中處于高甲基化水平，低表達狀態。本次實驗以NRK-52E細胞為研究對象，將細胞分為NC、HG和5-Aza-CdR組。結果發現，5-Aza-CdR組Dnmt3a和Dnmt3b表達較HG組降低，且在一定程度上恢復了Sfrp1的表達。同時5-Aza-CdR組NRK-52E細胞纖維化程度降低到接近正常細胞水平，提示Dnmt3a和Dnmt3b可能與Sfrp1甲基化有關，并影響腎臟纖維化的發生。此次實驗結果顯示col-Ⅲ、col-Ⅳ與Sfrp1呈負相關。提示，Sfrp1表達降低可能導致腎臟纖維化時細胞外基質沉積增多。

綜上所述，5-Aza-CdR可能通過抑制Dnmt3a、Dnmt3b的表達，改善腎臟纖維化，其機制可能與抑制Sfrp1甲基化，恢復Sfrp1表達有關，但Dnmt3a、Dnmt3b與Sfrp1的具體作用位點仍需進一步實驗研究。